诱导IPEC-J2细胞自噬的猪流行性腹泻病毒非结构蛋白筛选

作     者：刘海鑫 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李广兴

授予年度：2019年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪流行性腹泻病毒 IPEC-J2细胞 非结构蛋白 自噬 病毒增殖 

摘      要：猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）可以引起急性、高度接触性肠道传染病——猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）,近年来给我国养猪业造成了巨大的经济损失。各日龄猪均可感染PEDV,其中对哺乳仔猪的危害最为严重,死亡率可达90%00%。2010年末PEDV在我国南方地区开始流行,到2014年为止我国各地区猪场都可检出PEDV阳性。虽然国内灭活疫苗的使用在一定程度上抑制了PEDV的进一步扩散,但由于临床中不断有PEDV变异毒株的出现,传统疫苗的保护效果并不理想。PEDV仍是造成仔猪流行性急性腹泻的主要病原之一。细胞自噬（autophagy）是一种广泛存在于真核细胞中高度保守的溶酶体依赖性降解途径,对于维持细胞内环境稳态和清除损伤的细胞器至关重要。在外源性因素刺激下,自噬也可作为一种防御机制发挥作用。有研究表明自噬与癌症的发生、病原体感染等过程都具有密切的关系。许多病毒在感染宿主的过程中都可诱导细胞自噬的发生。为了探究PEDV CV777株感染IPEC-J2细胞诱导自噬的机制并筛选出参与诱导细胞自噬的PEDV关键非结构蛋白,我们展开了如下研究。首先将PEDV CV777株在IPEC-J2细胞中进行适应传代,利用透射电镜观察、Western blot检测和激光共聚焦免疫荧光等技术对PEDV是否诱导细胞自噬进行分析。结果显示PEDV感染后IPEC-J2细胞中自噬样双层膜囊泡结构增多,并诱导GFP-LC3在细胞内呈显著的点状聚集。Western blot结果表明自噬相关标志蛋白LC3-II和Beclin-1的表达明显上调,自噬底物标志蛋白p62则表现为降解趋势。说明PEDV侵染IPEC-J2细胞能诱导细胞完全自噬的发生。为了深入研究PEDV复制过程中各非结构蛋白对细胞自噬的影响,构建了PEDV各非结构蛋白的真核表达质粒,转染IPEC-J2细胞后检测各蛋白对细胞自噬的影响。结果显示PEDV非结构蛋白Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp8、Nsp10、Nsp14都可上调自噬相关基因LC3-II的表达,其中Nsp5和Nsp8引起的LC3-II的聚集效果极显著。我们选取Nsp5、Nsp6和Nsp8进行诱导细胞自噬的验证,在转染pCMV-Nsp5、pCMV-Nsp6和pCMV-Nsp8的基础上,以特异性小干扰RNA（siRNAs）对Nsp5、Nsp6和Nsp8的表达进行干扰。结果显示,siRNA使Nsp5、Nsp6和Nsp8失去诱导细胞自噬的能力。此外我们发现诱导细胞自噬可促进PEDV的增殖,而抑制细胞自噬则不利于PEDV的增殖。这说明细胞自噬与PEDV的增殖也有着密切的关系。本研究证明PEDV可诱导IPEC-J2细胞自噬,而细胞自噬有利于PEDV自身的增殖,并筛选出诱导细胞自噬效果显著的关键PEDV非结构蛋白Nsp5和Nsp8。本研究对于进一步探索PEDV非结构蛋白诱导细胞自噬的机制提供了理论依据和物质基础。