膜活性肽HPRP-A1与凋亡诱导肽kla的联合用药及抗癌作用机理研究

作     者：郝文静 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈育新

授予年度：2019年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：抗癌肽 HPRP-A1 kla 联合用药 线粒体 凋亡 

摘      要：癌症的高病发、高死亡、低生存趋势越来越严重,已经成为了21世纪危害人类健康的主要杀手。其中,肺癌和乳腺癌的发病率分别居我国男性和女性的癌症发病首位(国家癌症中心)。目前,临床治疗癌症的主要方法手段有放射治疗、化学治疗和手术治疗,这些传统治疗方式普遍存在用药靶向选择性低、毒副作用大、术后容易愈后复发等缺陷,使其抗癌疗效受到了很大的限制。近年来,抗癌肽因其具有广谱的生物活性和独特的作用机制备受关注,很多抗癌肽具有良好的肿瘤靶向性和穿透性,不易产生耐药性,部分抗癌肽还可激活机体免疫,因此有望成为抗癌新药的重要候选分子。在前期工作中,我们研究了两种具有不同理化特征和活性作用机制的抗癌肽,阳离子膜活性肽HPRP-A1与凋亡诱导肽kla。HPRP-A1呈α螺旋结构,具有良好的癌细胞膜渗透性与靶向性,高浓度可通过破膜导致癌细胞坏死。kla呈折叠结构,由全D型氨基酸组成,通过诱导线粒体凋亡的途径引发细胞凋亡,但其细胞的摄取率不高,很难进入细胞发挥活性作用。本课题以阳离子膜活性多肽HPRP-A1和凋亡诱导肽kla为研究对象,以肺癌细胞系A549和乳腺癌细胞系MCF-7为研究模型,对是否可以通过联合用药发挥两种多肽的互补协作效应,进一步提高抗癌肽的抗癌活性并降低其用药毒性的问题进行了研究。首先通过FMOC固相合成法合成多肽HPRP-A1与kla,并用高效液相色谱仪分析制备获得纯肽;其次,利用MTT实验和流式细胞术检测HPRP-A1与kla联合用药对肺癌细胞A549与乳腺癌细胞MCF-7细胞活性与增殖的影响。结果发现低剂量的HPRP-A1可以大大提高kla的抗癌活性,相对于A549,联合用药组对MCF-7的活性与增殖影响更为明显;再次,利用激光共聚焦显微镜检测多肽的细胞摄取与共定位,结果表明联合用药组可以明显提高细胞对多肽kla的摄取率,共定位显示多肽kla进入细胞后结合到线粒体上发挥活性作用;进一步,利用荧光显微镜与线粒体凋亡检测试剂盒检测联合用药对细胞线粒体影响,结果显示联合用药组引起了线粒体膜电位的明显变化,Western Blot实验证实kla通过引起线粒体膜电位的变化,导致线粒体膜破坏及线粒体内细胞色素C释放到胞质中;最后,构建小鼠体内乳腺癌模型,按天注射抗癌肽,观察癌症体积变化,并对用药后的组织器官进行免疫组化分析,结果显示,联合用药组有效抑制癌症的生长,并对正常组织没有毒性损伤。