miRNA-2954介导PI3K调控鸡缺硒性心肌凋亡和自噬的研究

作     者：刘琪 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张子威

授予年度：2019年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：硒缺乏 miRNA-2954 心肌 自噬 凋亡 

摘      要：硒是一种在人和动物体内维持机体生理功能和内环境稳态的重要的微量元素,对机体内分泌、免疫应答、炎症反应和生殖过程存在多重调控作用。硒缺乏可导致不同物种间的多种疾病,包括猪缺硒性桑葚心、鸡的脑软化、心肌损伤和人的克山病等等。此外,在禽类中,硒缺乏导致氧化应激增加和促进炎症发生,引起心肌细胞的凋亡、自噬和坏死发生,最终导致鸡的心肌损伤。近年来,miRNAs作为一种高度保守的小分子RNA,真核生物中广泛存在,并在细胞死亡途径和多种疾病发生过程中的重要调控作用,因此,逐渐成为研究的热门话题,miRNA在心肌疾病中的调控仍有待研究。该试验基于肉鸡的缺硒模型,对心肌组织的超微结构和组织病理学结果进行观察,利用miRNA组学检测技术检测缺硒心肌组织中差异表达的miRNAs,通过生物信息学分析,选择差异性最为显著且与心肌疾病存在密切关系的miRNA-2954进行后续研究,利用细胞转染技术建立体外miRNA-2954敲低/过表达模型,双荧光素酶报告基因测定用于确定靶向关系,并通过RT-PCR和Western印迹检测体外和体内的mRNA和蛋白质水平。自噬染色和流式细胞术用于检测心肌细胞中自噬和细胞凋亡的发生。主要研究结果如下:1)在该试验中,将180只雏肉鸡随机分成两组。向90只1日龄雏鸡喂食低硒(硒含量为0.008 mg/kg)日粮,另外90只雏鸡喂食正常日粮(硒含量0.2 mg/kg)30天。缺硒组肉鸡出现典型的缺硒症状显著的,剖检心脏有出血点,在超微结构观察结果中可见心肌出现典型自噬和凋亡特征,证实成功复制缺硒性鸡心肌损伤模型;病理组织学结果显示,与对照组相比,缺硒组心肌纤维明显肿胀、断裂以及明显的单核细胞浸润,证明缺硒可导致心肌组织的损伤。2)miRNA组学结果表明,鸡心肌组织中共检测出468个miRNA,其中缺硒组心肌组织与对照组相比,结果显示,有11个miRNAs表达存在显著差异,其中7个miRNAs上调,4个miRNAs显著减少,miRNA-2954的表达水平显著增加(P0.05)。经RT-PCR验证,与对照组相比,miRNA-2954的表达水平增加了3.5倍。上述结果证实miRNA组学的可靠性以及缺硒过程中,鸡心肌组织中miRNA-2954表达显著增加(P0.05)。3)基于组学和生物信息学预测,表明PI3K为miRNA-2954的靶基因之一,应用细胞转染技术建立miRNA-2954过表达和miRNA-2954敲低的肉鸡原代心肌细胞,结果显示过表达组心肌细胞miRNA-2954的表达上升75倍,敲低组心肌细胞内miRNA-2954降低了55%。表明原代培养心肌细胞miRNA-2954的过表达/敲低模型建立成功;随后结合双荧光素酶基因报告检测,RTPCR及Western blot等试验结果证实PI3K为miRNA-2954的靶基因。4)缺硒肉鸡心肌组织内自噬相关基因IRS、RAS、MEK1、MEK2、ERK、TSC1、TSC2、ULK1、ATG13、LKB1、BECLIN1和LC3的mRNA表达水平与对照组相比显著上升,而抗自噬相关基因mTOR和AKT的表达水平显著下降(P0.05);凋亡相关基因Caspase3、Caspase8、Caspase9、Cytc、BAX、BAK、P53、JNK和TNF的mRNA表达水平显著升高,而BCL2的mRNA水平下降;自噬通路蛋白LC3和BECLIN1表达增加,mTOR表达显著降低(P0.05);凋亡通路蛋白BAX,Caspase3,Caspase8表达增加,抗凋亡蛋白BCL2表达下降。结果表明,缺硒可诱导心肌组织自噬和凋亡的发生。5)体外培养原代心肌细胞,MDC染色显示过表达miRNA-2954的心肌细胞自噬显著增加。流式细胞仪检测结果显示,过表达组心肌细胞凋亡率明显高于对照组;miRNA-2954敲低组心肌细胞MDC染色和流式细胞术结果显示心肌细胞自噬和凋亡明显低于对照组。综上所述,miRNA-2954过表达可在鸡心肌细胞内通过抑制PI3K的表达,导致PI3K/AKT通路下游促自噬和凋亡相关基因和蛋白表达上升,抗凋亡基因和蛋白的表达降低。机体缺硒过程中,肉鸡心肌组织中miRNA-2954表达上调,并通过靶向抑制PI3K通路表达,导致心肌自噬和凋亡的发生,为缺硒引起的心肌疾病的诊断和治疗提供新的理论基础,为缺硒性心肌疾病的机制探究奠定基础。