低氧通过上调Notch1的表达抑制外周血间充质干细胞成骨分化的研究

作     者：杨民胜 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱立新

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：低氧 成骨分化 Notch1 外周血间充质干细胞 RNA干扰 

摘      要：研究背景:创伤、肿瘤和先天缺陷都会导致骨缺损,需要骨组织工程搭建支架材料进行缺损修复。种子细胞植入生物相容性支架上修复骨缺损具有十分重要的治疗作用。然而,由于支架内缺乏血管,种子细胞会暂时缺氧和营养缺乏,在骨折形成血肿部位氧气浓度低至0.8%,与空气中20%氧气浓度相比低得多,在骨缺损支架的中心,氧气浓度可能比血肿更低,因为组织液通过复合支架材料渗透较慢。研究表明,在骨缺损的复合支架材料中,只有一小部分种子细胞存活。在低氧甚至缺氧的恶劣条件下,对外周血间充质干细胞的影响尚不完全清楚,通过探讨低氧对外周血间充质干细胞增殖、存活、迁移以及成骨分化的影响,对创造适当的细胞培养或体内移植条件,以保持种子细胞的成骨潜力具有重要的指导意义。研究方法:本研究将从大鼠左心室抽取外周血并提取出外周血间充质干细胞(PBMSCs),培养于氧浓度分别为1%、9%和21%的低氧小腔室中。细胞增殖使用CCK8试验检测;用活/死细胞染色来检测细胞的存活情况:细胞的迁移能力用平板划痕试验检测;用RT-qPCR、Western blotting检测碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(OCN)、成骨相关转录因子抗体(Osterix)和Runt-相关转录因子2(Runx2)等成骨相关蛋内的表达情况来检测细胞成骨分化的情况:同时,通过慢病毒转染PBMSCs下调Notch1的表达,观察成骨基因和蛋白质的表达情况。结果:本研究发现,低氧(1%O2)对PBMSCs有促进增殖、增加迁移的作用,但在缺乏血清和氧气的条件下存活率下降。同时,9%的氧浓度促进成骨分化,但在1%的氧浓度下PBMSCs的成骨能力显著降低,并与Notch1的表达升高相关,通过siRNA下调Notch1基因的表达可显著恢复PBMSCs的成骨分化。研究意义:我们首次系统地探究了低氧对PBMSCs的增殖、存活、迁移和分化的影响,并研究发现下调Notch1的表达可促进成骨分化。这些结果对于建立合适的细胞培养或体内移植条件,以保持种子细胞的成骨潜力具有重要的指导意义,并且对外周血间充干细胞作为种子细胞修复骨缺损的新科学思路具有一定的指导作用。