Staurosporine及其衍生物增强ATRA诱导AML（非APL）细胞分化的研究

作     者：师蕾 

作者单位：上海交通大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蔡循

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：全反式维甲酸 细胞分化 星型孢菌素 MEK/ERK U937细胞 Enzastaurin 

摘      要：全反式维甲酸（All-trans-Retinoic Acid,ATRA）在急性早幼粒细胞白血病（Acute Promyelocytic Leukemia,APL）的治疗中取得了极大成功,但对其它类型的急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia,AML）疗效不佳。我们已有的研究证实,ATRA与staurosporine可以协同诱导ATRA耐药的APL细胞株——NB4-R1和NB4-R2细胞分化,但两药联合并不改变APL的重要致病蛋白——PML-RARα的蛋白含量,提示两药协同诱导细胞分化可能不涉及PML-RARα的调控。由此猜测,ATRA与Staurosporine联合应用可能对无PML-RARα融合蛋白的非APL的AML有效。我们以急性单核细胞性白血病细胞株——U937、慢性粒细胞白血病红白变细胞株——K562和急性髓系白血病M2b型细胞株——Kasumi为体外模型,研究ATRA和Staurosporine联合应用的细胞效应及其可能分子机制。研究显示,在对ATRA低度敏感的U937细胞中,2nmol/l Staurosporine可增强ATRA诱导的粒细胞分化;但是,Staurosporine和ATRA联合应用不能诱导对ATRA无反应的K562细胞和Kasumi细胞分化。随后,我们研究Staurosporine增强ATRA诱导U937细胞分化的可能分子机制。由于staurosporine是一强效广谱的PKC抑制剂,因此,我们首先研究它们对PKC的作用。研究发现,2nmol/l Staurosporine以及两药联合均不改变U937细胞的PKC活性,但高浓度Staurosporine（10nmol/l）确实可以抑制该细胞的PKC活性;同时,针对U937细胞内PKC不同亚型的选择性PKC抑制剂,如UCN-01,Go6976,和Rottlerin,均不能增强ATRA诱导U937细胞分化。由此,PKC可能并不参与Staurosporine增强ATRA诱导U937细胞分化的调控。进一步我们以ATRA诱导粒细胞分化的重要信号转导途径和蛋白为研究对象,研究Staurosporine增强ATRA诱导U937细胞分化的可能分子机制。C/EBPβ和C/EBPε是粒系终末分化重要的转录因子,并参与ATRA诱导APL细胞向粒细胞分化的调控。研究发现,Staurosporine显著增强ATRA对以上两种转录因子蛋白含量的上调作用。MEK/ERK信号转导途径是细胞因子以及ATRA诱导粒细胞分化所必需的。我们研究显示,Staurosporine和两药联合应用均可活化MEK和ERK;以MEK特异性抑制剂U0126阻抑MEK活性,可抑制Staurosporine对ATRA诱导U937细胞分化的增强效应;同时,也阻抑Staurosporine对ATRA促进的C/EBPβ和C/EBPε蛋白含量上调的增强作用。综上所述,Staurosporine增强ATRA诱导非APL的AML细胞分化可能仅局限于对ATRA低敏感的细胞;并且,可能不依赖于PKC,而是通过MEK/ERK信号转导途径,调控C/EBPβ和C/EBPε蛋白水平。在前一部分工作中,我们发现PKC非选择性抑制剂Staurosporine可以增强ATRA诱导的U937细胞分化。由于以上药物并不改变U937细胞内的PKC活性,而且PKC其他亚型抑制剂也不能模拟staurosporine的细胞效应。由此猜测,staurosporine的细胞效应可能与其特异性的化学结构相关。Staurosporine不仅是非特异性的PKC抑制剂,它还可抑制细胞内其它激酶（如肌球蛋白轻链激酶、CaM激酶和PKG等）的活性,迄今无法应用于临床治疗。Enzastaurin（LY-317615）是一种双吲哚马来酰亚胺类抗癌药,它是Staurosporine的无手性衍生物。临床I期试验证实,Enzastaurin为安全无毒性的药物,并在临床Ⅱ期和Ⅲ期试验中显示出抗肿瘤效应;更重要的是,它具有多种与staurosporine类似的生物学功能。本研究发现,Enzastaurin具有与staurosporine同等的增强ATRA诱导U937细胞向粒系分化的效应;并且Enzastaurin也显著增强ATRA对C/EBPβ和C/EBPε的蛋白含量的上调作用。MEK的特异性强效抑制剂Trametinb可以抑制Enzastaurin对ATRA诱导U937细胞分化的增强效应;同时,也阻抑Enzastaurin对ATRA促进的C/EBPβ蛋白含量上调的增强作用。以上结果说明,和staurosporine相似,Enzastaurin也是通过MEK/ERK信号转导通路介导的C/EBPβ的调控,增强ATRA诱导的U937细胞分化。