保加利亚乳杆菌/鼠李糖乳杆菌通过调控NF-κB拮抗AFB1所致肝脏炎性损伤

作     者：李蕊蕊 

作者单位：黑龙江八一农垦大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐闯

授予年度：2019年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：黄曲霉毒素B1 肝脏 保加利亚乳杆菌 鼠李糖乳杆菌 NF-κB 炎症反应 

摘      要：黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种广泛存在于自然界中的霉菌毒素,具有强毒性和强致癌性。AFB1污染常见于食品和饲料原料中,对食品工业和农牧业的发展构成了重大威胁,并间接危害人类健康。近年来,饲料原料采购选择和品控的严格要求使霉菌毒素污染得到了一定程度的控制,但玉米、豆粕、配合饲料中霉菌毒素的检出率仍处于较高水平。因此,寻求有效的黄曲霉毒素解毒剂已刻不容缓。为了降低黄曲霉毒素的危害,许多研究者提出了用益生菌对AFB1进行解毒的方法。我们在前期的预实验中发现,复合乳酸菌CS能够有效缓解AFB1导致的雏鸡肝损伤,但其中发挥主要作用的菌株及其作用机制尚不清楚。因此,本试验中我们挑选乳酸菌CS中两种主要的菌株,保加利亚乳杆菌和鼠李糖乳杆菌,来探讨它们对AFB1中毒的拮抗作用及保护机制。在本研究中,为了探讨保加利亚乳杆菌和鼠李糖乳杆菌对AFB1诱导的肝脏炎症反应的保护作用及分子机制,我们分别从体内试验和体外试验进行研究。一、体内试验:将健康雄性昆明小鼠随机分为五组,通过灌胃的方式用AFB1(300μg/kg)、保加利亚乳杆菌(10 mg/只)、鼠李糖乳杆菌(10 mg/只)持续处理8周。试验结束后统计小鼠体重及肝指数数据,剖检观察肝脏组织病理变化,采集血清检测肝功、肾功指标以及炎性因子变化,采集肝脏检测NF-κB和炎性因子表达量。二、体外试验:用不同浓度的保加利亚乳杆菌和鼠李糖乳杆菌分别刺激小鼠肝细胞(AML12),筛选对细胞活性没有影响的最适乳酸菌浓度,然后用AFB1、BAY11-7082(NF-κB抑制剂)、最适浓度的保加利亚乳杆菌和鼠李糖乳杆菌将细胞分成六个不同的处理组,每个处理组又分别刺激1 h、2 h、4 h和12 h。刺激结束后收集细胞及细胞培养上清,分别检测细胞中NF-κB信号通路相关蛋白、炎性因子表达量以及培养上清中炎性因子的浓度。体内试验结果显示:AFB1暴露小鼠肝组织出现明显病变,肝细胞部分坏死;肝指数显著增加(P0.05);血清肝功指标AST、ALT含量显著上升(P0.05),肝功指标TP及肾功指标BUN、CREA含量显著降低(P0.05);血清炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平显著升高(P0.05,P0.01),IFN-γ水平极显著下降(P0.01);肝脏炎性因子TNF-αmRNA表达量以及炎症信号通路中NF-κBp65 mRNA和蛋白表达量均极显著上调(P0.01),IκBα蛋白表达量极显著降低(P0.01)。然而,添加保加利亚乳杆菌或鼠李糖乳杆菌都不同程度的逆转了AFB1导致的上述指标的变化。在体外试验中,最终选择的对AML12细胞活性没有显著影响的乳酸菌刺激剂量分别为:保加利亚乳酸菌1.2 mg/mL,鼠李糖乳杆菌0.5 mg/mL。体外试验结果显示:鼠李糖乳杆菌显著减少了AFB1诱导的AML12细胞胞外炎性因子的分泌;保加利亚乳杆菌和鼠李糖乳杆菌都显著抑制了AML12细胞中AFB1导致的NF-κB的激活和表达以及IL-1β、TNF-α的mRNA表达量。体外试验最终结果与体内试验结果基本一致。以上结果表明,AFB1暴露可导致肝脏炎性损伤,而保加利亚乳杆菌和鼠李糖乳杆菌均可通过调节NF-κB信号通路的活性来拮抗AFB1诱导的肝损伤和炎症反应,减少炎性因子的分泌量。同时也说明保加利亚乳杆菌和鼠李糖乳杆菌具有拮抗AFB1毒性的潜力,可进行深入研究并将其转化为饲料添加剂来降低霉菌毒素对畜牧业的危害。