幽门螺杆菌感染促进胃癌相关成纤维细胞的活化及其与胃癌细胞的互作研究
作者单位：贵州医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：周建奖
授予年度：2019年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
主 题：胃癌 幽门螺杆菌 胃癌相关成纤维细胞 Serpin E1 IL-8
摘 要：目的:探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,***或HP)感染在胃癌癌周正常成纤维细胞(Normal fibroblasts,NFs)活化成肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)中的作用,以及CAFs与胃癌细胞之间的互作及其分子基础,从肿瘤微环境的角度探讨***感染与胃癌发生的分子机制。方法:(1)用*** 1004以感染复数(Multiplicity of infection,MOI)为50(***与细胞比为50:1)感染NFs、CAFs及肿瘤细胞AGS 7 d,免疫荧光染色(Immunofluorescence,IF)检测*** 1004的生长状态;Western blot检测***特异性性蛋白尿素酶B(Urease B)的表达。(2)NFs活化实验:分为直接感染和间接感染。直接感染分3组:(1)*** 1004直接感染NFs 7d;(2)AGS与NFs共培养7 d;(3)*** 1004、AGS及NFs共培养7 d。间接感染用0.4μm孔径的Transwell小室将*** 1004与NFs隔离培养,分为3组:(1)*** 1004(上室)/NF(下室),培养7 d;(2)AGS(上室)/NF(下室),培养7 d;(3)AGS+HP1004(上室)/NF(下室),培养7 d。用Western blot检测各组NFs中纤维细胞活化蛋白(Fibroblast-activating protein,FAP)和基底膜糖蛋白(Lumican,LUM)蛋白质的表达,评价NFs的活化状态;最后用Transwell实验检测NFs活化后对AGS迁移和侵袭的影响。(3)CAFs与AGS互作实验:用8μm孔径Transwell小室构建实验模型,分为4组:(1)AGS(上室)/CAF(下室)组,作为对照组;(2)AGS(上室)/CAF+HP1004(下室)组,用*** 1004感染CAFs 7 d;(3)AGS+HP1004(上室)/CAF(下室)组,用*** 1004感染AGS 7 d;(4)AGS+HP1004(上室)/CAF+HP1004(下室)组,用*** 1004同时感染AGS和CAFs 7 d;分别培养24 h(迁移)和72 h(侵袭),结晶紫染色并计数下室膜上迁移或侵袭的AGS细胞数。(4)细胞因子检测及ELISA验证:分别收集NFs活化实验中细胞培养液或CAFs与AGS互作实验中Transwell下室培养液,用细胞因子芯片检测培养液中细胞因子,选择其中的白细胞介素8(Interleukin-8,IL-8)及纤溶酶原激活物抑制剂E1(Serpin family E member 1,Serpin E1)用ELISA进行验证。(5)利用人类蛋白图谱(The Human Protein Atlas,HPA)数据库及GEPIA在线工具分析Serpin E1与胃癌的关系。(6)用Matrigel和I型鼠尾胶原蛋白构建三维培养模型,将CAFs或NFs与胃癌细胞SGC-7901混合接种在胶上,培养10 d,取下基质胶,福尔马林固定,石蜡包埋切片,进行HE染色。结果:(1)鉴定结果显示,*** 1004感染NFs、CAFs及AGS 7d后仍然可以黏附细胞生长,且高表达其特征性蛋白Urease B。(2)NFs活化实验结果:(1)无论直接感染还是间接感染,*** 1004感染NFs组、AGS与NFs共培养组及***1004、AGS和NFs共培养组,NFs中FAP及LUM表达均显著增强(P0.05),且*** 1004感染NFs能促进AGS细胞的迁移和侵袭(P0.05),提示***及AGS均能促进NFs的活化。(2)细胞因子芯片结果显示,*** 1004感染NFs后,细胞因子CCL2、Serpin E1含量显著增加,且新出现了IL-6及CXCL12;而AGS与NFs共培养,培养液中IL-8、IL-6等10个细胞因子含量增加,推测这些细胞因子参与了***和AGS诱导的NFs活化。(3)ELISA结果显示,*** 1004感染NFs、*** 1004感染AGS、及*** 1004、AGS与NFs共培养中Serpin E1含量显著增高(P0.001),IL-8含量显著降低(P0.01)。(3)CAFs与AGS互作实验结果:(1)*** 1004单独感染CAFs或AGS细胞,均可促进AGS细胞迁移侵袭,但是*** 1004同时感染CAF
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