NLK表达与黑色素含量在恶性黑色素瘤中的临床意义

作     者：杨钰莹 

作者单位：宁夏医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：柯亨宁;折虹

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：Nemo样激酶 黑色素瘤转移 血管生成 血管内皮生长因子受体2 恶性黑色素瘤 黑色素 cyclin D1 转移 免疫组织化学 Nanog shRNA 皮肤鳞状细胞癌 裸鼠移植瘤 

摘      要：第一部分NLK在黑色素瘤中表达下调与血管生成增加和转移相关目的本研究旨在探讨NLK在恶性黑色素瘤中的表达是否与VEGFR2相关的血管生成和黑色素瘤转移相关。方法本研究主要采用组织芯片和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)方法,检测175例恶性黑色素瘤患者组织中的NLK表达,并对VEGFR2阳性的微血管密度定量分析。结果免疫组化分析显示,在175例黑色素瘤组织中有129例(73.7%)NLK表达阳性,26.3%的黑色素瘤组织中无NLK的表达。在人原发性恶性黑色素瘤中,NLK的表达与患者的年龄、性别、TNM分期和原发灶是否有淋巴结转移无关。但是,在淋巴结转移性黑色素瘤中,NLK的表达明显低于原发性黑色素瘤(P=0.002)。此外,与NLK表达较高的组织相比,表达较低的组织中VEGFR2阳性的微血管密度较高。结论本研究结果提示NLK在恶性黑色素瘤中表达下调与VEGFR2相关的微血管形成和黑色素瘤转移有关。本研究提示NLK可作为一种新的预后指标来揭示黑色素瘤转移的新机制。第二部分恶性黑色素瘤的黑色素含量与其进展和转移相关性探讨目的探讨黑色素含量与细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达在恶性黑色素瘤中的临床病理意义。方法采用组织芯片和免疫组织化学方法,检测2001年1月至2014年12月共189例恶性黑色素瘤患者组织中的黑色素含量和cyclin D1表达。结果189例恶性黑色素瘤组织中的黑色素高含量者为76例(40.2%),cyclin D1高表达者为80例(45.7%)。黑色素含量与患者的年龄、性别、肿瘤组织来源和原发灶有无淋巴结转移无关,与肿瘤的侵袭深度(P=0.001)和临床分期(P=0.038)有关。T3、T4期黑色素瘤中的黑色素含量明显低于T1、T2期。同时,临床分期Ⅲ、Ⅳ期皮肤恶性黑色素瘤中的黑色素含量也明显低于Ⅰ、Ⅱ期。Cyclin D1表达与年龄、性别、侵袭深度、临床分期、原发灶有无淋巴结转移和肿瘤组织来源无关。黑色素含量和cyclin D1表达在58例淋巴结转移性恶性黑色素瘤中呈负相关(r=-0.271,P=0.039)。结论黑色素含量下调可能与恶性黑色素瘤的侵袭、进展和转移有关。本研究可为恶性黑色素瘤的预后因素分析和病理诊断提供新的依据。第三部分Sh RNA沉默Nanog基因对皮肤鳞状细胞癌A431细胞裸鼠移植瘤的影响目的建立Nanog稳定低表达的皮肤鳞状细胞癌A431细胞克隆,探讨sh RNA沉默Nanog基因后对A431细胞裸鼠移植瘤的影响。方法首先以PLKO.1-puro为载体构建携带sh RNA-Nanog的质粒,然后利用293T细胞系制备病毒悬液,再用病毒液感染A431细胞,最后根据质粒携带的抗性筛选稳定低表达Nanog的A431细胞克隆,并通过细胞模型和动物模型检测干扰效率。结果沉默Nanog组细胞经过puromysin筛选后,得到了稳定转染的细胞株。相对空白对照组,沉默Nanog组的细胞形态发生变化。Western blot结果显示,沉默Nanog组的印迹比空白对照组的印迹浅。CCK-8结果显示,Nanog基因沉默组的OD值在第3天和第4天比空白对照组明显降低,差异具有统计学意义。裸鼠移植瘤实验显示,相对于在32天终止实验时仍未发生肿瘤的Nanog基因沉默组,空白对照组的肿瘤出现时间早,肿瘤体积大,肿瘤重量重;肿瘤组织H&E染色显示空白对照组细胞增殖活跃,细胞核大小不一,胞浆丰富,形态紊乱。结论通过慢病毒介导的sh RNA转染方法,可以获得稳定低表达Nanog的A431细胞克隆。Nanog基因沉默后不仅可以抑制A431细胞的增殖,还可以抑制皮肤鳞状细胞癌A431细胞建立的裸鼠皮下移植瘤的生长。