扩展青霉脂肪酶的定向进化及稳定性的提高

作     者：谢盛 

作者单位：福建师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐良华

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：扩展青霉脂肪酶 稳定性 定点饱和突变 多拷贝工程菌 酶学性质 

摘      要：为了提高扩展青霉脂肪酶的稳定性,本研究采用了定点饱和突变的方法对影响酶稳定性的关键位点进行饱和突变,筛选出脂肪酶稳定性得到提高的突变菌株,并对其酶学性质进行测定和分析,主要有以下几个方面的内容。一、突变体文库的构建和高稳定性突变体的筛选对脂肪酶的83位点、92位点和151位点进行定点饱和突变,然后转化大肠杆菌感受态细胞。并筛选出稳定性比野生型提高的5个突变株:E83N、E83P、E83P、D92N 和 D151Y。二、多拷贝基因工程菌的构建扩展青霉脂肪酶PEL基因片段PCR扩增后,经EcoRⅠ酶切,异丙醇沉淀回收、与线性化后,并与去磷酸化的pA0815连接。转化Top10感受态细胞后,长出的转化子使用新设计的pAO-PEL引物进行菌液PCR鉴定,得到连接方向正确的单拷贝表达载体pA0815-lip.用BglII和BamHI双酶切pA0815-lip得到含5’(BglII)-AO X-lip-TT-3’(BamHI)的表达框,表达框经异丙醇沉淀回收、后与BamHI单酶切并去磷酸化的pA0815-lip连接,转化Top10感受态细胞。对长出的转化子用BglII和Ba mHI双酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定连接方向是否正确,得到正确连接的2拷贝表达载体pAO815-21ip。同理得到pA0815-3lip,pA0815-4lip表达载体。将得到的多拷贝表达载体pA0815-xlip经SalI酶线性化后,电转化毕赤酵母GS115,最后用YPOM平板鉴定得到的多拷贝基因工程菌GS-pA0815-xlip。三、多拷贝基因工程菌的表达及酶学性质的研究将上述得到的多个突变体毕赤酵母基因工程菌分别摇瓶发酵,并对收集到的脂肪酶的酶学性质进行了比较研究。(1)在37 ℃下测定E83V、E83P、E83N、D92N、D151Y等脂肪酶突变体对pNPB的比活力。其比活力分别为野生型脂肪酶的2.1倍,0.9倍,2.6倍,3.0倍,1.2倍。(2)野生型PEL(WT)和D151Y的Tm值大约为40.7℃,E83N 的 Tm 值约为 39.2℃(比野生型 Tm值低了 1.5℃)。D92N、E83P、E83V等突变体的Tm值分别为44.6℃,45.9℃,46.3℃.(分别比野生型Tm值提高了 3.9 ℃,5.2 ℃,5.6 ℃)。(3)用 10%乙醇处理 24h 后,E83N、D151Y 和 WT残留酶活分别为22.9%,36.3%和34.2%,而E83P残留酶活有70%(明显高于野生型),E83V和D92N残余的酶活也比野生型高。(4)在40 ℃条件处理下,WT的半衰期(T1/2)约为1h,而突变体E83N、E83P、E83V、D92N、D151Y的半衰期分别约为0.9h,2.0h,2.8h,2.0h,1.1h.分别是WT的0.9倍,2.0倍,2.8倍,2.0倍,1.1倍。(5)在10%不同有机溶剂处理24h下,五种突变体表现出不同的耐受性。经过甲醇处理后,WT相对残余酶活为24%,而E83V、D92N和D151Y相对残余酶活分别为56%,45%,43%(较WT有较大提高)。经过乙醇处理后,WT相对残余酶活只有31%,而E83P、E83V和D92N相对残余活分别为66%,71%,82%(较WT有明显提高)。经过二甲基亚砜处理后,WT和E83N相对残余酶活都为43%,E83V、D151Y相对残余酶活分别为62%,55%(较WT有较小幅度提高),E83P和D92N较WT反而下降。经过丙酮处理后,WT、E83N和E83P相对残余酶活都为33%左右,而E83V、D92N和D151Y相对残余酶活分别为61%,54%,62%(较WT有较大提高)。经过乙腈处理后,WT的相对残余酶活为32%,E83P、D92N较WT相对残余酶活反而下降,而E83N、E83V和D151Y有较小幅度提高。