XBP1s通过调控腹膜间皮细胞AQPs表达影响腹膜透析超滤

作     者：杨鸿泽 

作者单位：第四军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：许国双

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：腹膜透析 超滤失败 X盒结合蛋白1 水通道蛋白 条件性基因过表达/敲除小鼠 

摘      要：【背景】腹膜透析(Peritoneal Dialysis,PD)作为终末期肾病(End-stage Renal Disease,ESRD)患者有效的肾脏替代治疗方法之一越来越受到人们的重视,然而超滤失败(Ultrafiltration Failure,UFF)的发生是导致很多患者水钠潴留、心衰,甚至退出PD的重要原因。大量的研究证实腹膜对水分的清除与腹膜的水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)密切相关,而水分清除的重要性已越来越受到重视:来自墨西哥的ADEMEX研究以及中国香港等的研究证实溶质清除达到一定程度后再增加其清除并不能增加PD患者的长期存活率,而水分的清除在减少PD患者合并症以及增加PD患者的长期存活率方面发挥着至关重要的作用。内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)是负责蛋白质合成、修饰的场所,当内质网受到特定因素如缺氧、高糖、钙离子失衡、感染等刺激时,其稳态会被打破,导致内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ER stress)/非折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)的发生,UPR通过减少新生蛋白合成、增加内质网的折叠能力以及降解错误折叠蛋白等途径,消除在内质网的大量蓄积的未折叠蛋白和错误折叠蛋白,从而使细胞进入新的稳态。UPR包括IRE1α、ATF6以及PERK三条通路,其中,X盒结合蛋白1(X Box Bingding Protein 1,XBP1)是IRE1α通路中的关键分子。UPR发生时IRE1α通过非经典途径在细胞浆内将非剪切型XBP1(XBP1u)剪切成剪切型XBP1(XBP1s)。XBP1s是重要的转录因子,与细胞的分化、蛋白合成与分泌、炎症、脂质代谢和癌症等都有密切联系。由于XBP1s对蛋白表达,尤其是对膜表面蛋白表达的强大调控作用,我们有理由相信XBP1s有可能通过调控AQPs分子的表达而调控PD的超滤。【目的】1)寻找腹膜中优势表达的AQPs亚型;探究AQPs与腹膜透析超滤的关系。2)研究XBP1s与AQPs表达的相关性。3)验证XBP1s与AQPs表达的关系。【方法】1)取在腹膜透析置管术时留取的患者腹膜标本,免疫组化检测人腹膜组织中AQP1、2、3、4、5、7在腹膜组织中的分布位置和表达量,然后通过使用Real-time PCR与Western Blotting的方法在m RNA和蛋白表达水平来验证。2)提取人腹膜间皮细胞系(HPMCs)的RNA与蛋白,使用Real-time PCR与Western Blotting的方法检测AQP1、2、3、4、5、7在腹膜间皮细胞系中的表达情况。3)收集正在进行持续不卧床腹膜透析(CAPD)治疗的ESRD患者腹膜透析流出液细胞,根据超滤量的不同挑选出20个,分成四个组,Western Blotting检测不同患者流出细胞中AQP1的表达情况,用以观察研究AQP1与患者超滤之间的关系。4)使用XBP1s过表达与干扰慢病毒感染HPMCs,上调或下调XBP1s,嘌呤霉素筛选,并通过免疫荧光观测感染效率,再通过蛋白水平和m RNA水平验证XBP1s表达情况。5)在XBP1s过表达与干扰稳转HPMCs细胞系中使用Real-time PCR与Western Blotting的方法检测XBP1s上调或下调之后AQP1的表达变化。6)构建XBP1s条件性过表达与条件性敲除小鼠模型,并通过培育鉴定最终获得flox/flox纯合子小鼠。7)在XBP1s条件性过表达和敲除flox/flox纯合子小鼠模型中使用Cre-AAV腹腔注射的方法达到在小鼠腹膜组织中特异性过表达与敲除XBP1s,在注射后28天进行腹膜平衡实验(PET)获取超滤相关资料,并留取小鼠腹膜标本用于后续免疫组化、免疫荧光、Real-time PCR与Western Blotting等实验。8)通过实验数据分析小鼠敲除和过表达XBP1s之后AQP1的表达变化以及对超滤的影响。【结果】1)患者腹膜组织中主要表达的AQPs亚型是AQP1,另外有少量AQP3的表达,未检测到其他的AQPs亚型;而HPMCs中只检测到AQP1的表达。2)不同超滤量的CAPD患者腹膜透析流出液细胞AQP1的蛋白表达量与超滤量呈正相关。3)成功构建了XBP1s过表达与干扰稳转HPMCs细胞系。4)XBP1s干扰细胞系中AQP1的表达下调。5)XBP1s过表达细胞系中AQP1的表达上调。6)成功构建了XBP1s条件性过表达与条件性敲除小鼠模型,并通过培育鉴定最终获得纯合小鼠。7)小鼠PET实验、免疫组化和Western Blot等结果提示,与对照组相比,XBP1s敲除组小鼠腹膜组织XBP1s蛋白表达下调,同时伴有AQP1的下调,超滤量也显著减少;XB