重组脑膜炎球菌PorB蛋白对猪伪狂犬弱毒疫苗的免疫增强效力研究

作     者：石晓玉 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：侯继波;姜平

授予年度：2017年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：脑膜炎球菌PorB蛋白 粘膜免疫 PRV弱毒疫苗 免疫增强 

摘      要：猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病病毒引起的,可导致繁殖障碍的急性传染病。该病具有散播快、死亡率高、流行面广、传播方式多样、隐性感染等特点,给全世界养猪业带来了巨大经济损失。本病没有特效的治疗方法,免疫接种是预防和控制该病的主要措施。临床上使用的猪伪狂犬病疫苗有弱毒疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗和活载体疫苗。最常用的疫苗为弱毒疫苗和灭活疫苗,但近几年,由于弱毒疫苗存在毒力返强等缺点,造成仔猪免疫功能衰竭,从而使免疫失败,迫使人们不得不寻求更高效,安全的疫苗佐剂来增强疫苗的免疫效果,以达到预防和控制该病的目的。脑膜炎奈瑟氏球菌也称脑膜炎双球菌,属于奈瑟氏菌属,是脑膜炎的病原体,蛋白体(OMPs),是脑膜炎球菌的重要的抗原成分,是由三类孔道蛋白组成的囊泡,形状结构与纳米颗粒类似,能作为载体递送抗原到作用部位,同时又能作为免疫佐剂增强疫苗的免疫原性。蛋白体由PorA,PorB,class4三种孔蛋白组成,研究发现,蛋白体发挥免疫增强功能的主要组成成分是PorB蛋白分子。本研究成功实现了重组PorB蛋白在***中的可溶性表达,经纯化后,获得高纯度的蛋白作为PRV弱毒疫苗的稀释剂,初步探讨其对PRV弱毒疫苗的免疫增强效力,以期为流行毒株提供保护。本试验主要研究内容如下:1.重组PorB蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达在GenBank中查找脑膜炎球菌PorB蛋白氨基酸基因序列,对PorB基因进行大肠杆密码子优化后进行人工合成,将合成的基因插入到原核表达载体pET-32a中构建pET-32a-PorB表达载体。将鉴定正确后的载体转入*** BL21(DE3)中进行诱导表达。通过SDS-PAGE对目的蛋白的表达量和可溶性进行分析,利用Westem-blot对目的蛋白的反应原性进行鉴定。SDS-PAGE电泳分析结果表明PorB基因在大肠杆菌中能够可溶表达,Westem-blot结果显示,PVDF膜中在目的条带位置处有一条棕色条带。2.重组PorB蛋白的免疫增强性初步研究将表达产物进行Ni2+-NTA柱纯化,将每份含100μg吨纯化后的重组PorB蛋白与PRV弱毒苗混合后,分别鼻内免疫3日龄PRV阴性仔猪和肌肉注射免疫50日龄PRV阴性猪,免疫后14 d、28 d、42 d后分别测定3日龄实验猪的IgG、IgA抗体水平和中和抗体水平;测定50日龄实验猪的IgG水平、中和抗体水平、淋巴细胞增殖强度和细胞因子(IFN-γ,IL-10,IL-6)的含量。动物试验结果表明:与疫苗单独免疫组和PBS对照组相比,含有重组PorB蛋白佐剂组的特异性中和抗体、IgA和IgG抗体水平显著升高(P0.05);且含有重组PorB佐剂组可以诱导机体产生较强的细胞增殖反应和较高的IFN-y和IL-6细胞因子水平。通过本试验研究证明在猪伪狂犬弱毒疫苗免疫中,重组PorB蛋白可以作为一种优良的免疫增强剂,为未来发展的新型PRV弱毒疫苗佐剂奠定基础。3.重组PorB蛋白在大肠杆菌表达条件的优化通过对重组菌表达条件的摸索和优化,得出ZYM-5052自动诱导最优培养基成分为:2%蛋白胨、1%酵母提取物、2.5%甘油、0.05%葡萄糖、0.5%乳糖。在37℃培养1-2 h,降温至15℃再培养20 h。使用优化后的自动诱导培养基,可使重组PorB蛋白产量大幅度提高。