基于TLRS信号通路和胰岛素信号通路探究桑叶对T2DM治疗作用及其机制

作     者：王敏 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵保胜

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：桑叶 T2DM 炎症 TLRs 胰岛素通路 药效学 作用机制 

摘      要：研究背景:2型糖尿病(T2DM)是一种以糖脂代谢紊乱为特征的非传染性疾病,其多样化的致病因素和复杂的病理机制使T2DM已成为困扰和危害人类健康的重大疾病之一。近年来,随着对糖尿病研究的逐渐深入,越来越多的学者认为T2DM是一种与代谢相关的慢性炎性疾病。临床实践发现T2DM患者体内炎症因子处于高表达状态,实验研究也表明炎症因子的分泌与T2DM的产生有密切关系。临床治疗T2DM的药物以化药为主,虽然疗效显著,但多伴有一定的毒副作用,因此寻找新的降糖药迫在眉睫。中国传统医学对糖尿病的认识始于两千多年前,当时的古籍就有对类糖尿病症状的记录,现代中医学家认为T2DM属“消渴或“消瘅范畴,患者多因饮食不节、喜食油腻之物,致机体阴虚燥热,痰湿内阻,成痰成瘀,终成“消渴。根据糖尿病的不同病因病机,中医常采用不同的药物治疗,清热药桑叶为临床治疗T2DM的常用中药。现代药理学研究表明桑叶含有多种降糖物质,可以通过不同途径改善机体糖代谢。另有研究发现桑叶可以抑制多种动物模型的炎症反应,但桑叶能否通过抑制炎症反应治疗T2DM的研究报道较少,因此本课题基于TLRs介导的炎症信号通路和胰岛素信号通路,探讨桑叶调控炎症信号通路改善IR治疗T2DM的作用及其机制,阐明桑叶通过多信号途径发挥降糖作用的机制,为降糖中药药效与机制研究及降糖新药开发提供研究思路和实验依据。研究方法:本实验选择SPF级Wistar雄性大鼠为受试对象,以高脂高糖饲料喂养8周后,腹腔注射低剂量STZ,筛选空腹血糖≥12mmol/L的大鼠纳入实验,并对其胰腺进行病理学检查。受试药为桑叶水提物(高剂量(2.0g/kg),低剂量(1.0g/kg)),阳性药为二甲双胍(0.2g/kg),灌胃给药并继续高脂饲料喂养,持续12周。实验期间,每周选择固定时间称量大鼠体重与24 h进食饮水量,测量大鼠空腹血糖等基础指标,给药第11周,进行大鼠口服葡萄糖耐量试验(OGTT),给药第12周,进行大鼠胰岛素耐量试验(ITT)。第12周实验结束,取大鼠血清测定胰岛素含量,血脂TG、TC、LDL-C和HDL-C水平,炎症因子TN F-α、IL-6和CRP含量;取大鼠肝脏、肌肉组织进行病理学检测,Realtime-PCR技术分别测定大鼠肝脏组织TLR7-9 mRNA,骨骼肌TLRl-2mRNA,脂肪组织胰岛素信号通路蛋白InsR、IRSI、PI3K以及GLUT4mRNA的表达量。Western-blot技术检测肝脏和肌肉组织TLRs通路下游信号蛋白MyD88、TRAF6、NF-κB以及脂肪纽织胰岛素信号通路蛋白的表达最。研究结果:药效学实验表明,桑叶高剂量组大鼠第2周、8周、10周、11周、12周血糖明显降低,具有统计学差异(p0.05),桑叶高剂量组第3周、4周、12周饮水量显著减少(p0.05);OGTT结果表明,桑叶高剂量可以抑制大鼠灌胃葡萄糖后血糖升高的水平,降低AUC(p0.01);桑叶高剂量可以改善胰岛素耐受情况,降低大鼠HOMA-IR,差异具有统计学意义(p0.01);血清生化检测结果显示,桑叶高剂量组大鼠血清中TC、LDL-C含量出现明显下降,差异具有统计学意义(p0.05);ELISA结果显示桑叶可以降低T2DM大鼠血清CRP和IL-6的含量(p0.05或p0.01),但是与模型对照组比较,桑叶抑制T2DM大鼠体重降低的作用较弱,未出现统计学差异,桑叶给药组大鼠进食量降低不明显,桑叶低剂量组大鼠血糖降低不明显,对糖耐量及HOMA-IR改善作用较弱,桑叶低剂量抑制TC、LDL-C升高的作用不明显,差异没有统计学意义。机制研究发现,桑叶可以改善T2DM大鼠肝细胞脂肪变性,改善肌肉萎缩状态,降低肝脏和肌肉组织炎细胞浸润。PCR结果显示桑叶可显著降低T2DM大鼠肝脏TLR7-9mRNA相对表达量(p0.01),降低大鼠骨骼肌TLR1-2 mRNA相对表达量(p0.01);桑叶可以上调大鼠脂肪组织胰岛素信号通路InsR、IRS1、PI3K、GLUT4mRNA表达量(p0.05或p0.01)。We stern-blot结果表明桑叶可以降低T2DM大鼠肝脏和肌肉组织中MyD88、TRAF6、NF-κB等TLRs炎症信号通路下游蛋白的表达(p0.05);桑叶给药组大鼠脂肪组织胰岛素信号通路蛋白InsR、IRS1、PI3K、GLUT4表达量增加(p0.05或p0.01)。研究结论:桑叶可以降低T2DM大鼠血糖,改善葡萄糖耐量异常,改善大鼠胰岛素抵抗;桑叶可以降低T2DM大鼠TC、LDL-C含量,降低血清炎症因子CRP和IL-6含量;其降糖机制可能与抑制TLRs信号通路介导的炎症反应及改善胰岛素通路关键信号元件蛋白表达有关。