从痰瘀出发探讨肺纤方对VEGFR2介导的肺成纤维细胞活化增殖等研究

作     者：顾潇枫 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张晓梅

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：肺成纤维细胞 肺纤方 肺纤维化 痰瘀 VEGFR2 

摘      要：目的:通过文献研究、理论探讨与实验研究相结合的方式,探讨中医痰瘀理论与IPF的微观病理基础之间的联系,探究肺纤方抗纤维化的作用机制。方法:1.结合中医对痰瘀理论在IPF进程中的认识以及现代医学对IPF微观病理基础的研究,从痰热阻肺与炎性损伤、痰浊与胶原、瘀血与新生血管、痰瘀互生与肺成纤维细胞及肺微血管内皮细胞四个维度探讨中医痰瘀理论与IPF的微观病理基础之间的相关性。2.从乳鼠肺组织中分离培养肺成纤维细胞,采用VEGFR2(40、20、10、5mg/L)干预肺成纤维细胞构建肺成纤维细胞的活化、增殖模型,Western-Blot法检测α-SMA蛋白表达,确定VEGFR2干预浓度;用不同浓度肺纤方及泼尼松干预肺成纤维细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率,确定肺纤方及泼尼松的最大无毒浓度;分别对VEGFR2介导的肺成纤维细胞给予肺纤方水煎剂(100、25、6.25mg/L)干预并以泼尼松溶液(50mg/L)作为阳性对照,干预时间为24h,MTT法检测干预后各组成纤维细胞的增殖情况,RT-PCR、Western-Blot法检测各组成纤维细胞α-SMA、ColⅠ的mRNA与蛋白表达,RT-PCR法检测TGF-β1、TβR Ⅰ和Smαd3的mRNA表达的影响,Western-Blot法检测PI3K、AKt和pAKt的蛋白表达。结果:1.痰热阻肺与炎性损伤、痰浊与胶原、瘀血与新生血管在来源、功能、性质、特点等方面具有相关性;痰瘀互生与肺成纤维细胞、肺微血管内皮细胞协同作用具有相关性。我们认为肺成纤维细胞和肺微血管内皮细胞在功能以及病理产物上的相互促进,与中医痰瘀理论中的痰瘀互阻、互生相契合。在临床辨治IPF的过程中,要重视痰瘀共治。***2可促进肺成纤维细胞表达α-SMA蛋白(P0.05)。50mg/L泼尼松对细胞增殖有轻度促进作用(P0.05)。4.模型组及各实验组对肺成纤维细胞均有较强的抑制作用,肺纤方高、中剂量组及泼尼松组对模型细胞具有显著抑制作用(P0.05),Col Ⅰ基因表达明显降低(P0.05)。与模型组比较,,肺纤方高、低剂量组及泼尼松组可明显上调TGF-β1表达(P0.05)。与模型组比较,肺纤方低剂量组可显著下调PI3K蛋白表达(P0.05),肺纤方高、中剂量组及泼尼松组可明显下调pAKt蛋白表达(P0.05或P0.01)。结论:1.中医痰瘀理论与IPF的微观病理基础之间存在相关性,在IPF治疗上应重视痰瘀共治。***2可促进肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。3.肺纤方可通过抑制肺成纤维细胞增殖、分化,减少胶原沉积从而发挥抗纤维化作用,其机制可能与PI3K/AKt信号通路有关。