氢水对体外培养甲状腺相关眼病患者眼眶成纤维细胞的影响

作     者：陈欣欣 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：魏锐利

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

主      题：氢水 甲状腺相关眼病 眼眶成纤维细胞 氧化应激 

摘      要：研究目的甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)是一种自身免疫性疾病,发病机理尚未完全明了,目前临床和基础研究均发现氧化应激在TAO的发病过程中起到一定的作用,试验性的抗氧化剂治疗对于轻度、中度TAO也取得了比较理想的治疗效果。抗氧化剂氢水因其几乎无毒副作用,近年来被大量地研究,众多的医学和生物学方面的研究成果表明,氢水可以通过抗氧化、抗凋亡、抗炎作用,有效治疗因氧化应激导致的各器官损伤。本研究采用原代培养的眼眶脂肪结缔组织来源的眼眶成纤维细胞,研究氢水对于体外培养正常人和TAO患者眼眶成纤维细胞的影响,同时与地塞米松作对照研究,检测在过氧化氢(HO)氧化损伤眼眶成纤维细胞后,各种氧化应激指标:活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量的变化,并且检测眼眶成纤维细胞凋亡情况,增殖能力以及细胞内透明质酸(HA)的含量。研究方法1、取TAO患者及正常人的眼眶脂肪结缔组织,进行原代培养,获得稳定传代的眼眶成纤维细胞,并用形态学和免疫组化的方法鉴定。2、选取不同浓度的HO作用于正常人及TAO患者眼眶成纤维细胞,CCK-8法检测细胞18h后的增殖能力,为后续实验选取合适的过氧化氢浓度。3、将正常人和TAO患者的眼眶成纤维细胞分为几下几组:空白组、氧化损伤模型组、氢水+模型组、地塞米松+模型组。CCK-8法分别检测各组眼眶成纤维细胞0、24h、48h、72h的增殖能力。4、流式细胞仪检测上述各组眼眶成纤维细胞72h后的早期凋亡率、晚期凋亡率和坏死率。5、分光光度计法检测上述各组眼眶成纤维细胞72h后MDA、GSH-PX的含量。6、酶标仪法检测上述各组眼眶成纤维细胞72h后SOD的含量。7、流式细胞仪检测上述各组眼眶成纤维细胞72h后ROS的含量。8、将TAO患者的眼眶成纤维细胞分成三组:空白组、氢水组、地塞米松组,ELISA法检测各组细胞72h后HA的含量。结果1、本实验成功培养出眼眶脂肪结缔来源的成纤维细胞,经过形态学和免疫组化法鉴定其确为眼眶成纤维细胞,能够稳定传代,成功为后续实验建立细胞体系。2、不同浓度的HO作用于眼眶成纤维细胞18h后,根据其对细胞增殖能力的影响,最终选取100μmol/L的HO作为后续实验药物。3、氢水+模型组及地塞米松+模型组在24h、48h、72h所测的细胞增殖能力均显著高于氧化损伤模型组。4、与氧化损伤组相比,氢水及地塞米松在作用72h后均可以显著降低细胞晚期凋亡率和坏死率。5、氢水及地塞米松在作用72h后均可以显著降低氧化损伤后细胞的MDA含量,升高细胞GSH-PX含量。6、氢水及地塞米松在作用72h后均可以显著升高氧化损伤后细胞的SOD含量。7、氢水及地塞米松在作用72h后均可以显著降低氧化损伤后细胞的ROS含量。8、TAO患者眼眶成纤维细胞内HA含量显著高于正常人,氢水及地塞米松作用72h后均降低了TAO患者眼眶成纤维细胞的HA含量。结论TAO患者眼眶成纤维细胞的增殖能力高于正常人,氢水及地塞米松均升高了HO氧化损伤后眼眶成纤维细胞的增殖能力;TAO患者和正常人眼眶成纤维细胞的凋亡率和坏死率并无明显差异,但加入氢水和地塞米松作用于氧化损伤后的眼眶成纤维细胞后,TAO患者细胞的晚期凋亡率和坏死率明显高于正常人;氢水及地塞米松均可以通过降低氧化损伤后细胞MDA和ROS含量,提高SOD和GSH-PX的含量,抑制氧化应激反应;最后氢水及地塞米松均可以减少TAO患者OFs内HA的含量。