基于miR-145/Rab14/自噬探讨丹酚酸B对CGN的作用机制

作     者：周桔 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周玖瑶

授予年度：2018年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：慢性肾小球肾炎 丹酚酸B 系膜细胞 miR-145 自噬 

摘      要：慢性肾小球肾炎(Chronic Glomerulonephritis,CGN)系临床常见的免疫炎症性疾病,严重威胁着人类健康。炎症因子浸润和系膜细胞增殖异常是CGN最常见的病理改变,减轻肾脏炎症免疫反应是治疗CGN的关键。自噬是作为真核细胞中普遍存在的一种依赖溶酶体的胞内降解系统,能清除细胞中损伤或衰老细胞器及生物大分子,维持细胞自身稳态。自噬与肾小球系膜细胞、足细胞及肾小管细胞损伤密切相关,广泛参与各类肾脏疾病发生、发展,可能作为治疗肾脏疾病的一个新途径。此外,miRNA家族成员几乎参与调控自噬的每一个环节,可通过靶向调控自噬相关基因的表达,从而调节细胞自噬过程。在本课题组前期的研究中发现,丹酚酸B可以明显上调miR-145在肾小球系膜细胞中的表达水平,而miR-145与系膜细胞的异常增殖和炎性浸润密切相关。我们通过生物信息学软件预测发现,Rab14蛋白可能为miR-145的靶蛋白。Rab14蛋白能够在吞噬体膜聚集,导致吞噬体与早期内体结合作用增加,使得吞噬体和溶酶体无法结合,抑制自噬体成熟,最终抑制自噬活动。因此,本论文通过建立C-BSA慢性肾炎大鼠模型,观察丹酚酸B对CGN模型大鼠的干预作用以及对肾脏炎症的调控作用,基于miR-145/Rab14/自噬信号转导通路探讨丹酚酸B治疗CGN的作用机制。目的1、制备阳离子化小牛血清白蛋白(C-BSA)所致的CGN大鼠动物模型,应用丹酚酸B给药进行干预治疗,通过对大鼠24h尿蛋白含量、肾功能、氧化应激损伤、肾脏病理形态学改变情况、肾组织炎症因子含量的表达水平等指标的测定,评价丹酚酸B对CGN大鼠肾脏的保护作用。2、提取CGN大鼠肾脏RNA和总蛋白,利用qPCR法和Western Blot法检测大鼠肾组织中miR-145、Rab14蛋白及自噬相关蛋白的表达水平,探讨丹酚酸B对CBSA所致的肾炎模型大鼠肾脏保护的作用机制。3、培养人肾小球系膜细胞(HMC),利用脂多糖(LPS)进行刺激诱导,建立HMC炎性增殖模型,然后应用丹酚酸B干预治疗,观察丹酚酸B对HMC的增殖、凋亡及生长周期的影响作用。4、对HMC转染miR-145-5p的mimic和inhibitor,检测HMC中miR-145-5p的表达水平,明确丹酚酸B对miR-145的调控作用。同时探讨miR-145/Rab14/自噬信号通路的变化情况,揭示丹酚酸B对LPS刺激诱导的HMC保护作用的分子机制。方法1、观察丹酚酸B对CGN大鼠模型的干预作用取雄性SD大鼠,皮下多点注射C-BSA乳剂进行预免疫,一周后,连续尾静脉注射C-BSA建立CGN大鼠模型。自造模开始第三周起,给予丹酚酸B低、高剂量(50mg/kg、100 mg/kg),连续灌胃3周。测定大鼠尿蛋白、血肌酐、尿素氮、SOD、MDA、GSH等指标评价丹酚酸B对CGN大鼠肾功能的保护作用。取大鼠肾脏进行HE染色和PAS染色,观察大鼠肾脏组织的病理变化和系膜细胞增殖情况,免疫组化法测定肾脏组织Ki 67表达情况,免疫荧光观察肾小球IgG、C3沉积情况。以肾组织中IL-6、IL-1β的表达水平评价丹酚酸B对CGN大鼠免疫炎症的改善作用,综合评价丹酚酸B对CGN模型大鼠的干预作用。2、探讨丹酚酸B对CGN大鼠肾脏miR-145/Rab14/自噬信号转导通路的影响药物干预治疗3周后,提取大鼠肾脏组织总RNA,qRT-PCR法检测大鼠肾脏组织中miR-145的表达水平;提取大鼠肾脏总蛋白,Western Blot法检测肾组织Rab14蛋白以及自噬相关蛋白p62、Beclin1、LC3的表达情况,探讨丹酚酸B对CGN模型大鼠肾脏中miR-145/Rab14/自噬信号转导通路的影响。3、观察丹酚酸B对脂多糖(LPS)刺激的人肾小球系膜细胞(HMC)增殖、凋亡的影响培养人的肾小球系膜细胞(HMC),应用LPS刺激建立炎性增殖模型,给予丹酚酸B进行干预,MTT、CCK8法检测丹酚酸B对HMC增殖的影响;PI流式细胞术检测HMC生长周期;Anexin V/FITC检测丹酚酸B对HMC凋亡的影响。4、探讨丹酚酸B对LPS刺激的HMC模型中miR-145/Rab14/自噬信号转导通路的影响对HMC转染miR-145-5p的mimic(30nM)和inhibitor(100nM),qRT-PCR法检测miR-145-5p的表达情况,Western Blot法检测Rab14、p62、Beclin1、LC3蛋白的表达水平,研究丹酚酸B对miR-145/Rab14/自噬信号转导通路的影响作用。结果1、丹酚酸B对CGN大鼠模型的干预作用结果显示,与模型组大鼠相比较,丹酚酸B低、高剂量组能明显改善CGN模型大鼠的活动、进食、毛发光泽等情况,降低大鼠24 h的尿蛋白排泄量,同时还能降低血清中肌酐、尿素氮、MD