TLR4/JNK信号通路在脓毒症心肌损伤中的调控作用

作     者：胡立亚 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李培军

授予年度：2018年

学科分类：100218[医学-急诊医学] 1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：脓毒症 心肌损伤 动物模型 脂多糖 小鼠 Toll-样受体4 JNK信号通路 

摘      要：第一部分:脓毒症心肌损伤小鼠模型的建立和评价目的:通过腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)建立脓毒症心肌损伤小鼠模型,为脓毒症心肌损伤的发病机制研究提供一个稳定、可靠的实验手段。方法:将150只C57BL/6小鼠按随机数字表法分为正常对照组(NC组)、假手术组(Sham组)及LPS 10、12、15 mg/kg模型组,每组30只。经腹腔注射相应剂量LPS制备脓毒症心肌损伤模型;Sham组注射等量生理盐水;NC组不进行任何处理。每组15只用于观察制模前后动物一般状况,于制模后24 h行心脏超声检查心功能,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清c Tn I水平,观察心肌组织形态学和超微结构改变;其余15只用于观察制模后7 d的死亡情况。结果:腹腔注射LPS后,小鼠出现精神萎靡、毛发竖立、腹泻等脓毒症表现。与NC组比较,LPS 10、12、15 mg/kg组左室射血分数(LVEF)、左室缩短分数(LVFS)均显著降低[LVEF:0.459±0.044、0.432±0.034、0.348±0.064比0.588±0.019,LVFS:(22.36±2.60)%、(20.78±1.91)%、(16.27±3.31)%比(30.55±1.30)%,均P0.01],血清c Tn I水平显著增高(ng/L:270.40±43.50、281.14±41.79、298.39±42.05比192.59±16.90,均P0.01)。各剂量LPS组小鼠均出现心肌组织损伤,光镜下观察可见心肌纤维变性,间质水肿、出血,炎性细胞浸润等改变,透射电镜下观察可见心肌纤维排列紊乱、线粒体肿胀和嵴减少等改变,且LPS剂量越高损伤越严重。Sham组各指标与NC组比较差异均无统计学意义。LPS 10、12、15 mg/kg组小鼠制模后7 d死亡率分别为33%、53%、87%;NC组及Sham组小鼠无死亡。结论:以腹腔注射12 mg/kg LPS建立脓毒症心肌损伤小鼠模型较为理想。第二部分:TLR4/JNK信号通路在脓毒症心肌损伤中的调控作用目的:肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在脓毒症所致心肌损伤中发挥着十分重要的作用,本研究的目的是探究TLR4/JNK信号通路在LPS诱导TNF-α的表达及心肌损伤中的调控作用。方法:将C57BL/6小鼠按随机数字表法分为正常对照组(NC组,n=6)、生理盐水组(NS组,n=6)、LPS组(n=18)以及TLR4抑制剂(TAK-242)组(TAK-242组,n=18),LPS组和TAK-242组根据处死小鼠的时间点各分为3个亚组(n=6),即3h、12h、24h组。LPS组腹腔注射LPS 12mg/kg;TAK-242组腹腔注射TAK-2422mg/kg,1小时后腹腔注射LPS 12mg/kg;NS组腹腔注射等量生理盐水;NC组不进行任何处理。分别于处理后3h、12h、24h行心脏超声检查心功能;用ELISA法检测血清c Tn I及TNF-α水平;病理学方法检测心肌组织形态结构的改变;运用real-time RT-PCR技术从基因水平检测TLR4、JNK、c-jun的表达情况;采用Western Blot从蛋白水平检测TLR4、JNK、p-JNK、c-jun及p-c-jun的表达情况。结果:1、心功能的改变:与NC组相比,LVEF、LVFS:LPS组均显著降低(P0.01);LVESD、LVESV:LPS 3h、12h组均显著升高(P0.05);LVEDD、LVEDV:LPS 12h、24h组均显著降低(P0.05)。与LPS组相比,LVEF、LVFS:TAK-2423h组显著升高(P0.01);LVESD、LVESV:TAK-242 3h组明显降低(P0.05);LVEDD、LVEDV:TAK-242 12h、24h组均显著升高(P0.05),TAK-242 3h组明显降低(P0.01)。2、血清c Tn I、TNF-α水平的变化:与NC组相比,LPS可使血清c Tn I、TNF-α水平显著升高(P0.05);与同时间点LPS组相比,TAK-242组血清c Tn I、TNF-α水平均显著降低(P0.05)。3、LPS组小鼠出现心肌组织损伤,光镜下可见心肌纤维变性,间质水肿、出血,炎性细胞浸润等改变,透射电镜下可见心肌纤维排列紊乱、线粒体肿胀和嵴减少等改变。与LPS组相比,TAK-242组心肌组织损伤较轻。4、小鼠心肌组织中TLR4的表达情况:与NS组或NC组相比,LPS组TLR4m RNA及蛋白的表达量均显著升高(P0.05),且LPS 3h组最高;TAK-242 3h组m RNA和蛋白的表达量较LPS 3h组明显降低(P0.05)。5、小鼠心肌组织中JNK及p-JNK的表达情况:与