茶树γ-谷氨酰基转肽酶基因的克隆与功能分析

作     者：李海婧 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙俊;宛晓春

授予年度：2017年

学科分类：09[农学] 090203[农学-茶学] 0902[农学-园艺学] 

主      题：茶树 γ-谷氨酰基转肽酶基因 原核表达 真核表达 功能验证 

摘      要：γ-谷氨酰基转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase,γ-GGT）,又称γ-谷氨酰基转移酶,在生物体内广泛存在。已有研究表明***和***等微生物可利用GGT合成茶氨酸（N-乙基-γ-L-谷氨酰胺）,转化率达60%,反应时间短,且不需要ATP参与。因茶氨酸具有特殊的保健功能和药理作用,微生物来源的GGT已被构建于工程菌用于大量合成茶氨酸。茶氨酸是茶树中特征性的成分,迄今只在蕈和某些山茶科（属）植物中有报道。茶树新梢中茶氨酸含量约占茶叶中游离氨基酸总量的70%,茶叶干重的1%%。但目前有关茶氨酸合成的机理仍然不是很清楚。茶树中的GGT家族（CsGGTs）在茶树中对茶氨酸的合成发挥怎样的作用至今尚无报道。为此,本研究以“舒茶早为试材,克隆并初步分析了CsGGT的功能;检测了该基因在茶树不同器官中的表达量。具体结果如下:（1）借助茶树cDNA文库信息从“舒茶早幼芽中克隆了两条γ-谷氨酰基转肽酶基因,分别命名为CsGGT2和CsGGT4,同源比对分析结果显示CsGGT2和拟南芥GGT1、GGT2和萝卜GGT1、GGT2同源性高,CsGGT4和拟南芥GGT4和萝卜GGT3同源性高。（2）利用荧光定量PCR技术检测茶树芽、第一叶、第二叶、第三叶、第四叶、第五叶、根和茎不同器官中CsGGT2/CsGGT4的表达量,结果显示,CsGGT2的表达量为第一叶芽茎第二叶、第三叶、第四叶、第五叶和根,CsGGT4的表达量为茎第一叶芽第二叶、第三叶、第四叶、第五叶和根。（3）用HPLC检测茶树不同器官的茶氨酸含量,结果显示,根芽第一叶、茎第二叶、第三叶、第四叶和第五叶。（4）利用原核和真核两种异源表达方法检测了CsGGT2和CsGGT4的表达活性。原核表达后分别检测了CsGGT2和CsGGT4的体内、粗酶及纯酶活性,结果只在粗酶中检测到了γ-谷氨酰基转肽酶活性;分析了不同pH（5、6、7、8、9和10）对CsGGT2和CsGGT4粗酶酶活的影响,结果表明,pH=10时,二者γ-谷氨酰基转肽酶活性最高,HPLC检测显示此条件下茶氨酸含量最高;LC-MS-MS检测结果表明转CsGGT2/CsGGT4菌株粗酶中茶氨酸的含量高于对照。同时利用发根农杆菌K599异源转化大豆的方法检测了转基因株系中CsGGT2和CsGGT4的活性,结果显示,在饲喂不同浓度的谷氨酰胺和盐酸乙胺后的不同时间段,经HPLC检测,转基因株系中均没有茶氨酸生成。