有氧运动对早期心衰大鼠的干预中miR-10和miR-542靶蛋白的研究

作     者：王莉莉 

作者单位：天津体育学院 

学位级别：硕士

导师姓名：赵云罡

授予年度：2018年

学科分类：0403[教育学-体育学] 040302[教育学-运动人体科学(可授教育学、理学、医学学位)] 04[教育学] 1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：miR-10a-5p miR-542-5p 靶基因 

摘      要：目的:rno-mi R-10a-5p和rno-mi R-542-5p是本实验室首次鉴定的参与有氧运动干预慢性心衰进程的两个micro RNA。它们在压力负荷致慢性心衰大鼠的心室肌中低表达,以有氧运动为干预手段,可以使它们的表达量显著升高,同时伴有线粒体功能的增强及心衰进程的延缓。本研究的目的是鉴定rno-mi R-10a-5p和rnomi R-542-5p在心肌细胞中的可能靶蛋白,通过靶蛋白的功能研究探讨有氧运动干预心力衰竭的mi RNA机制,为慢性心衰的干预寻找突破口。方法:1、RIP免疫共沉淀与靶基因的筛选:在H9C2大鼠心肌细胞中过表达rno-mi R-10a-5p或rno-mi R-542-5p,通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)技术,用特异性Argonaute2(Ago2)蛋白抗体对过表达mi RNA的细胞中的RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)进行免疫共沉淀,并提取其中富集的m RNA。通过基因芯片法检测富集的m RNA的种类,然后进行聚类分析。初步筛选候选基因,通过mi RBase、Target Scan、RNAhybrid数据库进行计算预测。了解候选基因的主要生理功能,来进行靶基因的进一步筛选。2、引物设计:利用Oligo Primer Analysis Software 7对候选靶基因进行RTq PCR引物的设计。合成后用SYBR Green定量PCR来验证引物是否能够扩增出片段以及是否会出现二聚体的情况,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的验证。3、SYBR Green实时定量PCR:分别从离体水平和在体水平检验候选基因的表达情况。离体水平上,在H9C2大鼠心肌细胞中,过表达mi R-10a-5p或者mi R-542-5p,提取细胞总RNA,进行RT-q PCR;在体水平上,分别取假手术安静组(SC)、假手术运动组(ST)、手术安静组(AC)、手术运动组(AT)四组的大鼠左心室组织,进行组织RNA的提取,通过RT-q PCR检测基因表达水平。结果:1、通过对基因芯片的GO富集情况分析,发现大多数基因是与心脏的形态,血管的发生、线粒体的形态以及细胞凋亡和炎症相关,这与我们实验的最初构想是一致的,也为之后进一步探究有氧运动对早期心衰大鼠的干预机制奠定基础。2、通过筛选和验证,mi R-10a-5p的靶基因可能为Fat4;mi R-542-5p的靶基因可能为Tfrc和Vav2。RT-q PCR结果显示,在H9C2大鼠心肌细胞中过表达mi R-10a-5p,钙黏蛋白Fat4与转染空载体相比增加明显;在H9C2大鼠心肌细胞中过表达mi R-542-5p后,Vav2基因与转染空载体相比表达增加。在造模动物组织中也进行了相应的验证,转铁蛋白受体Tfrc在早期心衰模型中表达明显上调,在心衰后运动组中表达恢复正常水平,表明转铁蛋白受体在这一生理活动中发挥着重要的作用。Vav2在早期心衰大鼠的左心室表达明显降低,经过为期8周的有氧训练,大鼠的心功能得到了很大恢复,Vav2的表达情况较早期心衰组有明显的提高,说明Vav2在维持心血管的稳态方面发挥着重要的作用。在早期心衰大鼠中Fat4表达明显下调,但早期心衰后进行有氧运动虽表达量有所增加,但AC组和AT组并没有显著差异。研究表明在早期心衰大鼠的左心室组织中,COXⅣ的表达明显低于假手术安静组,经过为期8周的有氧运动,COXⅣ的表达与心衰安静组相比有所增加。结论:通过基因芯片的分析和进行细胞、组织层面的实时定量荧光PCR的验证,我们发现,在有氧运动干预心力衰竭的过程中,Fat4作为mi R-10a-5p的可能靶基因,Tfrc和Vav2作为mi R-542-5p的可能靶基因,起到了调节的作用。其中,Fat4与细胞增殖有关,转铁蛋白受体Tfrc与心脏线粒体的氧化磷酸化功能和自噬有关,Vav2与心血管的稳态有关。因此,这三个基因在有氧运动干预心衰中可能起到了关键的作用。其具体信号通路有待于进一步研究。