LincRNA-ROR作为竞争性内源RNA与人食管鳞状细胞癌关系的研究

作     者：尚牧禾 

作者单位：东南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘冉

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：食管癌 linc-ROR 竞争性内源RNA miR-145 miR-204 肿瘤标志物 

摘      要：背景和目的:食管鳞状细胞癌,即食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC),因其病灶处具有丰富的粘膜下层淋巴管网络而获得极强的转移性,导致其生存率低下而预后极差,中国是ESCC的高发国家,若能找到灵敏的生物标志有利于ESCC的早期诊断和治疗。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)被证实对人类疾病尤其是肿瘤的发生发展相关基因的表达起调节作用,其中可能存在ESCC相关的生物标志。LincRNA-ROR(linc-ROR,ROR)被发现在多种肿瘤中表达上调且具有促进肿瘤生长或侵袭的能力,而ROR与ESCC的关系却鲜有报道。因此本研究检测了ROR在ESCC组织和细胞中的表达,分析了ROR表达与ESCC发病风险的关系,识别了ROR对ESCC细胞恶性表型的影响,探讨了ROR调控ESCC发生发展的信号通路机制。研究方法与结果:一、ROR与ESCC发病风险和不良预后关系的研究本研究收集了2010年淮安市第一人民医院的91例ESCC患者的癌组织及配对癌旁组织,用qRT-PCR技术检测ROR的表达,结果表明,与癌旁组织相比,癌组织中ROR的表达水平显著增高,为癌旁组织的1.717倍(p0.001),比值比(odds ratio,OR)为2.138(p0.01);本研究还对3种ESCC细胞株KYSE510,EC109,EC9706和1株永生化食管上皮细胞H5E46进行了ROR的表达检测,发现ROR在ESCC细胞中表达显著高于正常食管细胞,分别是其2.5倍、10.8倍和29.5倍(p0.001)。说明ROR表达水平的升高与ESCC的发病风险显著相关,可能是ESCC的危险因素之一。本研究还收集了TCGA数据库中的96例ESCC患者的RNA测序芯片数据进行ROR与ESCC患者的生存分析,结果显示ROR表达水平较高的患者的生存时间短于ROR水平较低的患者(p0.001),说明ROR的高表达与ESCC患者不良预后有关。二、ROR对ESCC细胞恶性表型的影响通过慢病毒转染构建稳定过表达ROR的EC109细胞株以进行后续的细胞功能试验,通过qRT-PCR检测转染效率,过表达组(处理组)细胞的ROR水平大约为阴性对照组的16000倍。分别检测处理组和对照组细胞的活力、增殖力、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭能力。结果表明,处理组细胞的活力、增殖能力、迁移和侵袭能力均强于对照组,而凋亡率低于对照组,且处理组细胞中处于S期的细胞多于对照组。1.采用CCK-8法检测细胞活力。在给药后0.5h、1h、2.5h和4h分别检测吸光度,处理组均高于对照组,且具有时间效应关系。给药4h后,与对照组相比,处理组细胞的OD值增高了34.1%(p0.001),处理组的细胞活力高于对照组。2.采用EdU细胞增殖检测法检测细胞增殖力。结果显示,处理组进入增殖期的细胞数占比为(35.77±3.83)%,对照组进入增殖期的细胞数所占比为(30.70±5.11)%,与对照组相比,实验组进入增殖期的细胞增加了16.7%(p0.001)。3.采用PI染色法通过流式细胞仪检测细胞周期。处理组和对照组的G0/G1期占比分别为(62.28±2.32)%、(65.56±1.14)%,G2/M期占比分别为(13.83±0.91)%、(13.17±0.58)%,S期分别为(23.90±1.53)%、(21.27±0.44)%,(p0.001,n=3),其中处理组进入S期的细胞比对照组增加了12.4%,相对应地,处理组的G0/G1期细胞比例比对照组降低。4.采用Annexin V-APC/7-AAD染色通过流式细胞仪检测细胞凋亡。处理组凋亡率为(8.13±0.76)%,对照组凋亡率为(11.97±2.05)%,处理组细胞的凋亡率低于对照组(p0.05),与对照组相比,处理组的凋亡细胞减少了32.0%。5.采用Transwell小室检测细胞迁移。处理组的穿膜细胞数为50.71±6.35,对照组的穿膜细胞数为23.60±5.37,处理组的穿膜细胞数显著高于对照组(p0.001)。6.采用Transwell小室检测细胞侵袭。处理组的穿膜细胞数为38.75±6.05,对照组的穿膜细胞数为32.19±6.42,处理组的穿膜细胞数显著高于对照组(p0.01)。三、ROR作为ceRNA调控ESCC的信号通路分析为了进一步研究ROR可能作为竞争性内源RNA(ceRNA)参与调控ESCC的信号通路,本研究收集了TCGA数据库中的161例食管癌组织和11例癌旁组织的RNA测序芯片数据进行筛选得到差异表达基因,包括82个miRNA和1398个mRNA,筛选标准为p0.05,容错率(FDR)0.1,差异表达倍数(FC)≥2。在这82个miR