耐盐节杆菌的SOD诱导、纯化及性质研究

作     者：刘妮娜 

作者单位：南京工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何冰芳

授予年度：2006年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 

主      题：耐盐节杆菌 锰型超氧化物歧化酶 环境胁迫 诱导 纯化 性质 

摘      要：超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,简称SOD)(EC.1.***.1.1)系一类金属酶,广泛存在于生物体中,它能够催化超氧阴离子O·发生歧化反应,从而清除超氧阴离子,在生物体防御氧化损伤的过程中发挥着重要作用。根据酶分子中所含金属辅基的不同,超氧化物歧化酶主要可分为Cu Zn-SOD(多存在于真核生物),Mn-SOD(存在于原核细胞和真核细胞线粒体),Fe-SOD(存在于原核细胞和高等植物叶绿体)等类型。Mn-SOD和Fe-SOD的氨基酸组成相似,可能起源于同一祖先。 野生型高度耐盐节杆菌(Arthrobacter pascens DMDC12)经柠康酸体系培养后,导致胞内超氧化物歧化酶(SOD)大量表达。该菌的无细胞粗酶液SDS-PAGE表明,随着培养过程中碳源柠康酸的利用,分子量约24KDa处的蛋白产生了显著诱导,经N-末端测序证实该蛋白为SOD。本研究首次探讨了微生物生长环境胁迫作用对菌体SOD活力的影响,在转速相同的平衡实验中,采用四种不同碳源或能源的培养体系,该菌的SOD活性产生了显著差异,在柠康酸培养体系中,SOD的比活为葡萄糖、酵母膏、柠檬酸培养基培养后所得比活的280%、240%和180%。表明该培养体系对菌体产生一定的胁迫压力显著促进了SOD的表达。 本研究从高度耐盐菌A. pascens DMDC12中提取分离超氧化物歧化酶(SOD)。粗酶液经50%～75%硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sapharose FF阴离子交换及Source 15Q阴离子交换层析,获得了电泳纯的SOD,亚基分子量23.3KDa。纯化酶比活力为2183U/mg,纯化倍数为53,回收率51%。 对所纯化的酶中含有的金属辅基的类型进行测定,表明该超氧化物歧化酶对氯仿:乙醇敏感,对HO不敏感,且该酶在280nm处有最大吸收,因而可以推测本研究所纯化的超氧化物歧化酶为锰型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)。金属离子对SOD酶活的影响表明,Mg, Zn, Ba ,Cu对酶产生微弱抑制,Fe对酶的抑制显著,0.5mM的Mn对酶有激活作用。进一步证实其为Mn-SOD。 A. DMDC12 SOD具有较好的热稳定性和pH稳定性。酶在45℃以下基本稳定,在pH值5～9范围内稳定,并对4mol/L高浓度的脲显示了较好的稳定性。相关研究进一步验证了极端微生物可为Mn-SOD提供高效的酶源。