柞蚕EcR、USP和HK基因的克隆及表达研究

作     者：汝玉涛 

作者单位：沈阳农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦利;王勇

授予年度：2018年

学科分类：090504[农学-特种经济动物饲养（含：蚕、蜂等）] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：柞蚕 滞育 蜕皮激素受体 超气门结合蛋白 己糖激酶 基因表达 

摘      要：滞育(Diapause)是昆虫受到外界环境条件的刺激,通过稳定的遗传方式进行的一种预定静止的休眠方式,对昆虫应对不良环境,保障种群及个体生存有着重要的意义。柞蚕Antheraea pernyi是以蛹滞育的完全变态昆虫,具有较高的营养、药用及纺织价值。因地理环境的不同而致使化性发生变化,分为一化性和二化性。柞蚕蛹的滞育有利于种茧保存,而滞育的解除控制着柞蚕生产的起始,因此柞蚕滞育解除机制的研究不仅对于柞蚕生产具有着十分重要的意义,而且对于阐明蛹滞育昆虫滞育机制也具有重要意义,并为防治蛹滞育昆虫提供新的思路。本研究以柞蚕为材料,采用分子生物学的研究方法,研究了柞蚕滞育激素调控中的蜕皮激素受体基因、超气门结合蛋白基因以及糖代谢调控中的己糖激酶基因在解除滞育及发育过程中发挥的作用,结果如下:1.柞蚕蜕皮激素受体和超气门结合蛋白基因的克隆及表达研究根据柞蚕转录组数据库设计引物,克隆了柞蚕蜕皮激素受体和超气门结合蛋白基因,分别命名为ApEcRB1(GenBanK登录号:KY411159)和ApUSP1(GenBank登录号:KY411160)。2个基因的ORF序列全长分别为1 758 bp、1 401 bp,编码585个、466个氨基酸。半定量RT-PCR检测这2个基因在精/卵巢、丝腺和脂肪体等组织中表达,其中在丝腺和脂肪体中表达量较高。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析2个基因在幼虫蜕皮前及化蛹前后呈现大幅度上调表达的规律。注射20-羟基蜕皮甾酮(20E)诱导启动滞育蛹发育,结果滞育蛹诱导组经过17 d羽化,比对照组滞育蛹提早羽化。滞育蛹中2个基因的表达量在注射20E后均明显下降,其中ApEcRB1在蛹发育后期的12 d内一直处于较低水平,但羽化前期其表达量急剧上升,蛹发育16 d(羽化前1 d)达到最高;ApUSP1基因的表达量从注射后8 d开始升高,至16 d时达到最高。以上结果表明蜕皮激素能够通过介导昆虫蜕皮激素受体和超气门结合蛋白基因的表达变化来控制柞蚕的生长、发育、变态。2.柞蚕滞育蛹解除滞育过程中己糖激酶基因的克隆及表达研究昆虫能够将消化吸收的葡萄糖在脂肪体中转化为海藻糖或作为糖原储存,当机体需要能量时,海藻糖再转化为葡萄糖进入糖酵解途径,己糖激酶(hexokinase,HK)在此转化过程中起着重要的作用。为研究柞蚕蛹解除滞育及发育过程中的糖类代谢规律,克隆了柞蚕2个己糖激酶同工酶基因,分别命名为ApHK1和ApHK2(GenBank登录号:KY624592,KY624593)。2个基因的ORF全长分别为1 455 bp、1 362 bp,编码484个、453个氨基酸。系统进化分析发现柞蚕HK1和HK2蛋白分布于2个不同的进化分支上,不同种类昆虫的同一类型的HK具有更高的同源性。柞蚕5龄幼虫各组织中,2个HK基因在脂肪体中的表达水平都较高,ApHK2在各组织中均有表达,分布比ApHK1更广,且在中肠、肌肉内也有较高表达。以一化性柞蚕滞育蛹脂肪体组织为材料,采用qRT-PCR分析长光照(17 h/d)处理柞蚕蛹滞育解除及发育过程中HK基因的表达规律,结果表明:2个HK基因的表达量在处理后21 d明显升高,其中ApHK2的表达量升高了3.1倍;化蛹后42 d,ApHK1的表达量升高了2.8倍,而ApHK2的表达量无显著变化。以上研究结果表明ApHK1和ApHK2在柞蚕光照解除滞育及发育过程中发挥着重要的作用,并且2个基因的调控功能因组织糖代谢途径的不同而有所不同。3.柞蚕滞育解除过程中己糖激酶活性及葡萄糖含量变化研究采用紫外分光光度计法测定了柞蚕蛹滞育及滞育解除过程中葡萄糖含量及酶活性变化,结果表明蛹脂肪体中己糖激酶的活性在长光照处理下高于对照组,前期呈现上升趋势,处理后28 d达到最高值,此后逐渐下降并于处理后35 d趋于稳定,而蛹血淋巴中葡萄糖含量呈先下降后上升的趋势,这与脂肪体中己糖激酶的活性具有相关性。研究结果显示在蛹发育中期己糖激酶酶活力及葡萄糖含量之间呈现出互补关系,即己糖激酶的活性增强,血淋巴中葡萄糖的含量减少。