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家蚕微粒子虫分泌蛋白己糖激酶NbHK对家蚕基因表达及相关通路的调控作用

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微生物学报 2024年第4期64卷 1203-1218页

作者：文远邹子筠汪春霞于滨周泽扬李田西南大学资源昆虫高效养殖与利用全国重点实验室重庆400715 西南大学微孢子虫感染与防控重庆市重点实验室重庆400715 重庆师范大学生命科学学院重庆400047

【目的】微孢子虫是一种营专性细胞内寄生的微生物,它可以感染几乎所有动物种类,包括人类和重要的经济动物。本研究对家蚕微粒子虫分泌蛋白己糖激酶(Nosema bombycis hexokinase,NbHK)在家蚕胚胎细胞中表达特征、亚细胞定位、调控作用... 详细信息

【目的】微孢子虫是一种营专性细胞内寄生的微生物,它可以感染几乎所有动物种类,包括人类和重要的经济动物。本研究对家蚕微粒子虫分泌蛋白己糖激酶(Nosema bombycis hexokinase,NbHK)在家蚕胚胎细胞中表达特征、亚细胞定位、调控作用和宿主互作蛋白质进行了系统分析,为阐明该蛋白在侵染中的作用与机理提供参考。【方法】利用原核表达蛋白免疫小鼠,制备NbHK的多克隆抗体,并利用Western blotting和间接免疫荧光法分析家蚕微粒子虫在感染的家蚕胚胎细胞(Bombyx mori embryo,BmE)中的表达和定位;通过过表达和RNA干扰实验,分析NbHK对病原增殖的作用;利用RNA-seq分析NbHK调控的家蚕基因表达和通路;利用生物素-链霉亲和素系统和质谱技术,从NbHK::APEX2转基因细胞中分离鉴定NbHK的互作蛋白。【结果】在感染家蚕微粒子虫的BmE中,NbHK持续上调表达,主要被定位于宿主细胞核内。过表达NbHK显著促进了病原增殖,而敲低NbHK则明显抑制了病原增殖,说明在NbHK感染过程中发挥关键作用。利用RNA-seq分析鉴定了94个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),其中58个基因上调,36个基因下调。DEGs的富集分析显示,细胞寿命和内质网蛋白加工通路受到显著激活,而线粒体自噬途径受到明显抑制。互作蛋白鉴定分析发现,NbHK可能与宿主细胞核内的核蛋白易位启动子区(nucleoprotein translocated promoter region,NTPR)等蛋白间存在相互作用。【结论】NbHK主要被定位至家蚕细胞核中,调控家蚕细胞寿命等多个重要通路的基因表达,以利于病原增殖。本研究为深入解析NbHK在感染过程中的功能及其调控机理提供了新的参考。

关键词：微孢子虫家蚕微粒子虫己糖激酶分泌蛋白功能

高热稳定性己糖激酶在大肠杆菌中的表征和表达优化

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生物工程学报 2024年第9期40卷 3171-3188页

作者：李倩妮舒泉先杨小雁赵运英周胜虎邓禹江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江南大学江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心江苏无锡214122 山东渤海实业集团有限公司、山东省油脂油料精深加工技术重点实验室山东滨州256599

己糖激酶是血糖检测中的重要诊断试剂,因此对其酶活和热稳定性要求较高。目前国内己糖激酶主要依赖进口,大多是酵母来源酶,其价格昂贵且存在热稳定性较差等问题,限制了国内血糖诊断试剂的开发。因此,当前亟待实现高活性、高热稳定性己... 详细信息

己糖激酶是血糖检测中的重要诊断试剂,因此对其酶活和热稳定性要求较高。目前国内己糖激酶主要依赖进口,大多是酵母来源酶,其价格昂贵且存在热稳定性较差等问题,限制了国内血糖诊断试剂的开发。因此,当前亟待实现高活性、高热稳定性己糖激酶的高效表达。本研究在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中异源表达了一种来源于嗜热菌的ATP依赖型己糖激酶(glucokinase,Glk),发现其对葡萄糖特异性高、依赖Mg2+,最适pH和温度分别为8.5和80℃,在30-37℃下保存7 d后酶活保留90%以上,属于热稳定的偏碱性葡萄糖激酶。随后系统优化了Glk表达的培养基、诱导时机、诱导剂终浓度、诱导温度、诱导时长等因素,优化后Glk表达量相比于优化前提高了4.71倍。Glk纯化后,比酶活达到(43.05±2.00)U/mg,纯度达到95%以上。本研究开发的高热稳定己糖激酶的表达和纯化方法,为突破血糖诊断试剂制备中的短板提供了更多可能性和发展空间。

关键词：己糖激酶葡萄糖血糖检测表达优化热稳定性

朱砂叶螨己糖激酶HXK466基因克隆及特征分析

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北京农学院学报 2024年第4期39卷 1-5页

作者：王一冉赵周仪李剑男卜春亚北京农学院生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室北京102206

【目的】为了深入探索并寻找一套高效、环保的生物学防治策略来抵御朱砂叶螨的侵害。【方法】克隆朱砂叶螨己糖激酶HXK466基因,探明该基因序列的生物信息学特征,分析其序列组成、结构域分布以及潜在的调控位点,运用实时荧光定量PCR方法... 详细信息

【目的】为了深入探索并寻找一套高效、环保的生物学防治策略来抵御朱砂叶螨的侵害。【方法】克隆朱砂叶螨己糖激酶HXK466基因,探明该基因序列的生物信息学特征,分析其序列组成、结构域分布以及潜在的调控位点,运用实时荧光定量PCR方法,对朱砂叶螨的卵、幼螨、若螨和成螨4个关键发育阶段的样本进行测定。【结果】成功克隆己糖激酶HXK466基因(GenBank登陆号:PP536561.1),基因全长1518 bp,阅读开放框为1422 bp,编码473个氨基酸;己糖激酶HXK466基因在朱砂叶螨的卵、幼螨、若螨和成螨四个阶段中都有一定的表达。其中成螨阶段表达量最高,其次为若螨和幼螨,卵阶段的表达量最低。预测到朱砂叶螨HXK466为非跨膜蛋白和疏水性蛋白,己糖激酶HXK466基因目的蛋白共有4种二级结构,其中a-螺旋占比最高为43.13%,延伸链占比14.16%,β-转角占比4.23%,无规则卷曲占比为38.48%。【结论】克隆得到朱砂叶螨己糖激酶HXK466基因,明确其不同时期的表达特征,构建以己糖激酶为靶标的新型生物杀螨剂,为生物农药领域的创新奠定基础。

关键词：朱砂叶螨己糖激酶基因克隆荧光定量PCR

家蚕微粒子虫分泌蛋白己糖激酶NbHK对家蚕基因表达及相关通路的调控作用（英文）

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微生物学报 2024年第4期 1203-1218页

作者：文远邹子筠汪春霞于滨周泽扬李田西南大学资源昆虫高效养殖与利用全国重点实验室西南大学微孢子虫感染与防控重庆市重点实验室重庆师范大学生命科学学院

【目的】微孢子虫是一种营专性细胞内寄生的微生物，它可以感染几乎所有动物种类，包括人类和重要的经济动物。本研究对家蚕微粒子虫分泌蛋白己糖激酶(Nosemabombycis hexokinase, NbHK)在家蚕胚胎细胞中表达特征、亚细胞定位、调控作... 详细信息

【目的】微孢子虫是一种营专性细胞内寄生的微生物，它可以感染几乎所有动物种类，包括人类和重要的经济动物。本研究对家蚕微粒子虫分泌蛋白己糖激酶(Nosemabombycis hexokinase, NbHK)在家蚕胚胎细胞中表达特征、亚细胞定位、调控作用和宿主互作蛋白质进行了系统分析，为阐明该蛋白在侵染中的作用与机理提供参考。【方法】利用原核表达蛋白免疫小鼠，制备NbHK的多克隆抗体，并利用Western blotting和间接免疫荧光法分析家蚕微粒子虫在感染的家蚕胚胎细胞(Bombyxmoriembryo,BmE)中的表达和定位；通过过表达和RNA干扰实验，分析NbHK对病原增殖的作用；利用RNA-seq分析NbHK调控的家蚕基因表达和通路；利用生物素-链霉亲和素系统和质谱技术，从NbHK::APEX2转基因细胞中分离鉴定NbHK的互作蛋白。【结果】在感染家蚕微粒子虫的BmE中，NbHK持续上调表达，主要被定位于宿主细胞核内。过表达NbHK显著促进了病原增殖，而敲低NbHK则明显抑制了病原增殖，说明在NbHK感染过程中发挥关键作用。利用RNA-seq分析鉴定了94个差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)，其中58个基因上调，36个基因下调。DEGs的富集分析显示，细胞寿命和内质网蛋白加工通路受到显著激活，而线粒体自噬途径受到明显抑制。互作蛋白鉴定分析发现，NbHK可能与宿主细胞核内的核蛋白易位启动子区(nucleoproteintranslocatedpromoterregion,NTPR)等蛋白间存在相互作用。【结论】NbHK主要被定位至家蚕细胞核中，调控家蚕细胞寿命等多个重要通路的基因表达，以利于病原增殖。本研究为深入解析NbHK在感染过程中的功能及其调控机理提供了新的参考。

关键词：微孢子虫家蚕微粒子虫己糖激酶分泌蛋白功能

己糖激酶-Ⅱ基因在人结肠癌细胞中的表达及其治疗意义

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中华医学杂志 2007年第15期87卷 1058-1062页

作者：彭秋平梁后杰周琪周进明傅晓岚钟大平第三军医大学附属西南医院肿瘤科重庆400038 第三军医大学免疫学教研室

目的检测己糖激酶-Ⅱ基因(HK-Ⅱ)在人结肠癌细胞中的表达,探讨抑制 HK-Ⅱ对结肠癌的治疗效应及机制。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和 Western 印迹检测4种人结肠癌细胞 HK-Ⅱ基因的表达情况。在 HK-Ⅱ抑制剂(3-BrPA)诱导下,通过... 详细信息

目的检测己糖激酶-Ⅱ基因(HK-Ⅱ)在人结肠癌细胞中的表达,探讨抑制 HK-Ⅱ对结肠癌的治疗效应及机制。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和 Western 印迹检测4种人结肠癌细胞 HK-Ⅱ基因的表达情况。在 HK-Ⅱ抑制剂(3-BrPA)诱导下,通过 MTF 法观察结肠癌细胞增殖和化疗敏感性变化;用琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡 DNA 片段;底物比色法测定半胱氨酸蛋白水解酶(caspase-3)活性;流式细胞术和紫外分光光度仪分别检测线粒体膜电位(ΔΨm)、线粒体膜通透转换孔(PTP)开放的变化。结果 HK-Ⅱ基因在4种人结肠癌细胞中明显表达。抑制 HK-Ⅱ(3-BrPA)能明显控制结肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。300μmol/L 3-BrPA 刺激 LOVO、HCT-116、HT-29、SW480细胞48 h 后,细胞增殖抑制率分别为83.7%±2.0%、83.4%±4.1%、89.7%±3.7%和80.6%±0.9%。与小剂量3-BrPA(25 μmol/L)联合作用 LOVO 细胞48 h,低剂量表阿霉素(0.05、0.1μg/ml)的细胞增殖抑制率由5.1%±1.3%和10.5%±2.0%分别增至46.5%±3.2%和57.9%±3.3%(P<0.01);而低剂量 L-OHP(0.5、1.0μg/ml)的细胞增殖抑制率则由19.2%±6.1%和32.2%±2.2%分别提高到48.4%±3.2%和60.5%±4.6%(P<0.01)。50、100、150 μmol/L 3-BrPA 诱导 LOVO 细胞24 h 后,caspase-3活性分别为1.13±0.11、1.60±0.20和3.03±0.11(P=0.000)。3-BrPA 作用 LOVO 细胞线粒体20 min 后,PTP 开放程度为40.0%±3.5%,而对照组(CaCl_2)为37.4%±2.3%,两者相比,差异无统计学意义(P=0.348)。100 μmol/L 3-BrPA 刺激LOVO 细胞1、3、5 h 后,ΔΨm下降率分别为12.7%、15.4%、26.8%。结论 HK-Ⅱ基因可望成为结肠癌的有效治疗靶点。

关键词：结肠直肠肿瘤糖原酵解己糖激酶线粒体药物疗法

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己糖激酶2在肝癌转移中的调控作用

中华肿瘤杂志 2016年第10期38卷 739-742页

作者：耿西林龙卫红海军张煜郑伟张智勇杜立学陕西省人民医院肝胆外科西安710068

目的探讨己糖激酶2（HK2）在肝癌中的表达及其在肝癌转移中的调控作川。方法采用免疫组化法分析73例肝癌及癌旁组织中HK2的表达。小十扰RNA（siRNA）干扰HK2的表达后，采用细胞划痕实验检测肝癌细胞的运动能力，Transwell实验检测肝癌... 详细信息

目的探讨己糖激酶2（HK2）在肝癌中的表达及其在肝癌转移中的调控作川。方法采用免疫组化法分析73例肝癌及癌旁组织中HK2的表达。小十扰RNA（siRNA）干扰HK2的表达后，采用细胞划痕实验检测肝癌细胞的运动能力，Transwell实验检测肝癌细胞的侵袭能力，实时荧光定量聚合酶链式反应和Westernblot检测肝癌细胞中调控上皮间质转化（EMT）关键分子E-cadherin、ZO-1、N—cadherin和vimentin的表达．分析HK2在肝癌细胞EMT中的调控作用。结果免疫组化结果显示．肝癌及癌旁组织中HK2的表达水平分别为5．39±3．40和2．16±1．55，差异有统计学意义（P〈0．05）。siRNA干扰HK2的表达后，肝癌细胞的相对迁移距离由1．00±0．54下降至0．56±0．09，差异有统计学意义（P〈0．05）；细胞侵袭数南（345±42）个下降至（215±34）个，差异有统计学意义（P〈0．05）；肝癌上皮细胞标志物E-eadherin和ZO-1的表达上调，而间质细胞标志物N-cadhefin和vimentin的表达下调。结论HK2在肝癌细胞中的表达升高，通过促进细胞EMT过程而促进肝癌转移。

关键词：肝肿瘤己糖激酶肿瘤转移上皮间质转化

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己糖激酶与植物生长发育

植物生理学通讯 2003年第1期39卷 1-8页

作者：秦巧平张上隆徐昌杰浙江大学园艺系杭州310029

介绍了植物己糖激酶亚细胞定位、酶特性、基因克隆和表达及其在糖信号转导中的作用的最新研究进展。

关键词：己糖激酶植物生长发育果糖激酶葡萄糖激酶基因信号转导

体外研究己糖激酶Ⅱ在缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用

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中华烧伤杂志 2019年第2期35卷 116-124页

作者：易若凡林洁志崔琳张琼贾杰只吕艳玲张东霞黄跃生陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院全军烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400038

目的探讨己糖激酶Ⅱ在体外培养的缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用。方法取6只1~2 d龄雌雄不限C57BL/6小鼠,分离心脏并培养原代心肌细胞,取原代细胞进行以下实验。(1)按照随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为6组,即正常对照3、... 详细信息

目的探讨己糖激酶Ⅱ在体外培养的缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用。方法取6只1~2 d龄雌雄不限C57BL/6小鼠,分离心脏并培养原代心肌细胞,取原代细胞进行以下实验。(1)按照随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为6组,即正常对照3、6、9 h组及缺血缺氧3、6、9 h组,每组4孔。DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)48 h后,正常对照3、6、9 h组更换新鲜DMEM/F12培养基分别培养3、6、9 h,缺血缺氧3、6、9 h组更换无糖无血清培养基后于37℃含体积分数1%氧气、体积分数5%二氧化碳的低氧培养箱(缺氧培养条件下同)内分别培养3、6、9 h。细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力。(2)细胞分组及处理同实验(1),每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞微管相关蛋白1轻链3 Ⅰ(LC3 Ⅰ)、LC3 Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达。(3)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9 h组和缺血缺氧9 h+2-脱氧葡萄糖(2-DG)组,每组4孔。常规培养48 h后,正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9 h;单纯缺血缺氧9 h组更换无糖无血清培养基,缺血缺氧9 h+2-DG组更换溶有物质的量浓度为10 mmol/L 2-DG(20 μmol)的无糖无血清培养基,2组均缺氧培养9 h。CCK-8法检测细胞活力。(4)细胞分组及处理同实验(3),每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞LC3 Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白表达。(5)细胞分组及处理同实验(3),每组2孔。透射电镜下观察心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体情况。(6)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9 h组、缺血缺氧9 h+己糖激酶Ⅱ小干扰RNA1(HK-ⅡsiRNA1)组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组,每组4孔。正常对照组和单纯缺血缺氧9 h组常规培养48 h,缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组分别转染200 nmol/L HK-ⅡsiRNA1和HK-ⅡsiRNA2后常规培养48 h。正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9 h,单纯缺血缺氧9 h组、缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组更换无糖无血清培养基后缺氧培养9 h。CCK-8法检测细胞活力。(7)细胞分组及处理同实验(6),每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞LC3 Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达。除实验(5)外,各实验均重复3次。对数据行单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果(1)缺血缺氧3、6、9 h组心肌细胞活力分别为0.450±0.022、0.385±0.010、0.335±0.015,分别明显低于对应正常对照3、6、9 h组的0.662±0.026、0.656 ±0.028、0.661±0.021(t=6.21、9.12、12.48,P己糖激酶Ⅱ蛋白表达均显著增加(t3h=16.15、10.99、5.30,t6 h=6.79、10.42、9.42,t9h=15.76、16.51、7.20,P<0.05或P<0.01)。(3)单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞活力为0.353±0.022,较正常对照组的0.673 ±0.027明显降低(t=9.29,P<0.01);缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞活力为0.472 ±0.025,较单纯缺血缺氧9 h组明显升高(t=3.60,P<0.05)。(4)与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显增加(t=9.45、8.40,P<0.01);与单纯缺血缺氧9 h组比较,缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显减少(t=4.39、4.74,P<0.05)。(5)正常对照组心肌细胞中仅可见个别双层膜结构的自噬体/自噬溶酶体;与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞中双层膜结构的自噬体/自噬溶酶体明显增多;与单纯缺血缺氧9 h组比较,缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体数量明显减少。(6)单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞活力为0.358±0.023,较正常对照组的0.673 ±0.026明显降低(t=9.12,P<0.01);缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA2组心肌细胞活力分别为0.487 ±0.027、0.493±0.022,较单纯缺血缺氧9 h组明显升高(t=3.63、4.28,P<0.05)。(7)与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己

关键词：缺血缺氧肌细胞,心脏己糖激酶自噬细胞活力

沙葱萤叶甲己糖激酶基因的克隆、相对表达量及RNA干扰效应

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植物保护学报 2020年第6期47卷 1210-1218页

作者：马红悦李玲李艳艳谭瑶庞保平内蒙古农业大学草原昆虫研究中心呼和浩特010020

为揭示沙葱萤叶甲Galeruca daurica己糖激酶基因的功能,根据本课题组组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆获得沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长序列,分析其编码蛋白... 详细信息

为揭示沙葱萤叶甲Galeruca daurica己糖激酶基因的功能,根据本课题组组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆获得沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长序列,分析其编码蛋白的氨基酸序列与其它昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,采用实时荧光定量技术(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定不同发育阶段和不同温度下沙葱萤叶甲己糖激酶基因的相对表达量以及对RNA干扰的响应。结果表明,沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长为1699 bp,开放阅读框长为1479 bp,编码492个氨基酸;沙葱萤叶甲己糖激酶氨基酸序列与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera己糖激酶氨基酸序列一致性最高,为65.42%。己糖激酶基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,成虫滞育期间相对表达量维持在低水平,而滞育结束后相对表达量急剧上升达最高值。在0~40℃范围内,随着温度增加,己糖激酶基因在沙葱萤叶甲成虫体内相对表达量呈先升高后下降的趋势。采用RNA干扰技术沉默沙葱萤叶甲成虫己糖激酶基因2 d后,与对照相比,己糖激酶基因相对表达量下调90%以上,4 d后仍下调40%以上;该基因干扰后12 d内,沙葱萤叶甲成虫存活率下降了25%以上。表明己糖激酶基因可能在沙葱萤叶甲生长发育和滞育过程中起着重要作用。

关键词：沙葱萤叶甲己糖激酶基因克隆表达量 RNA干扰滞育