Gα、NO、cGMP在拟南芥插条不定根发生中的作用及与系统伤信号ROS的相互关系研究

作     者：颜美 

作者单位：陕西师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄爱霞

授予年度：2017年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：系统信号 拟南芥插条 活性氧 G蛋白 一氧化氮 环鸟苷酸 不定根生成 生长素 

摘      要：插条是不定根研究的经典体系,其切取过程会导致切断部位产生伤害及与整体植物之间关联的中断。大量研究表明植物激素生长素(IAA)在插条不定根形成中起着关键的作用。而切断处理会产生大量伤信号,如乙烯、水杨酸、活性氧(ROS)等。我们实验室前期研究表明ROS作为系统伤信号在插条切口处迅速产生并向上传导至茎尖调控生长素的运输从而诱导生根。那该过程中ROS是如何起作用的,是否有其他信号分子参与其中?我们拟对此进行研究。本文以拟南芥野生型Co1-0和相关突变体插条为实验材料,借助药理学处理、激光共聚焦技术和基因表达分析等方法,研究了异三聚体G蛋白α亚基(Gα)、NO、环鸟苷酸(cGMP)在拟南芥插条不定根发生中的作用及与系统伤信号ROS相互关系。所得结果如下:1、Gα激活剂CTX促进野生型Co1-0插条不定根产生,而Gα阻遏剂PTX则显著抑制生根。Gα过表达突变体wGα插条不定根发生明显增多而Gα缺失突变体gpα1-3和gpα1-4插条生根减少,表明Gα可以正调控拟南芥插条不定根的发生。2、NO清除剂c-PTIO、NR抑制剂Nα2W04均抑制野生型插条生根,NO供体SNP促进生根而NR突变体Niα2-1、Niα1-2/Niα2-5插条切后生根减少但Niα1-2生根变化不明显。内源NO检测表明Co1-0插条切后20min NO开始显著增加且逐渐沿胚轴向插条上部传导,Niα2-1、Niα1-2/Niα2-5插条NO产生显著抑制,表明Niα2基因来源的NO作为系统信号参与插条生根。3、鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583显著抑制Co1-0插条生根而cGMP的类似物8-Br-cGMP促进生根,δ-FlincG转基因拟南芥插条胚轴中cGMP水平在切后3h开始显著增加且有沿胚轴向插条向上部传导的趋势,显示cGMP作为早期信号参与拟南芥插条不定根的发生。4、H202促进gpα1-4突变体在体胚轴不定根生成及wGα内源H202产生,ROS积累抑制剂DPI、CAT具相反效应。突变体gpα1-4插条胚轴内源ROS水平显著降低而wGa突变体则显著升高。同时,CTX诱导Co1-0和突变体AtrbohF插条中ROS水平及不定根数目增加,但对突变体AtrbohD和AtrbohD/F效应不明显,此外DPI、CAT抑制CTX促生根作用。与对照相比wGα插条中RBOHD基因表达量上调明显,gpa1-4插条则下调其表达。以上结果表明Gα通过RBOHD基因调控系统伤信号ROS的产生从而调控不定根发生。5、H202促进Co1-0和Nia1-2突变体在体胚轴生根但不能诱导Nia2-1和Nia1-2/Nia2-5突变体在体生根,同时,DPI、CAT也抑制NR相关突变体插条生根。但SNP逆转降低ROS水平而导致的生根抑制。H2O2可以诱导在体胚轴中内源NO产生及传导,DPI、CAT抑制内源NO水平,但NO相关试剂对ROS的产生及传导无显著影响,此外,AtrbohD和AtrbohD/F插条中内源NO生成受到抑制但Nia2-1和Nia1-2/Nia2-5插条中ROS水平并不受到抑制。这些结果说明NO作为系统伤信号ROS的下游信号参与调控拟南芥插条生根。6、8-Br-cGMP可显著逆转降低ROS积累而导致的生根抑制,但LY83583、8-Br-cGMP并不能影响Col-0中ROS的产生及传导,外源H2O2可以显著增加在体δ-FlincG转基因拟南芥胚轴中的cGMP水平,ROS积累抑制剂则抑制插条胚轴中内源cGMP水平,说明cGMP作为系统伤信号ROS的下游信号参与调控插条生根。7、CTX诱导Col-0和Nia1-2的插条生根及胚轴内源NO增加,但是对NR突变体Nia2-1、Nia1-2/Nia2-5的不定根发生和内源NO没有促进作用,同时也无法逆转c-PTIO和Na2WO4对生根的抑制作用,但是SNP可以逆转gpα1-4的不定根抑制效果。wGα插条内源NO水平高于Col-0插条,但gpa1-4则较Co1-0低的多。同样发现CTX增加δ-FlincG转基因拟南芥胚轴中的cGMP水平,而PTX具相反作用,8-Br-cGMP可以逆转gpα1-4的不定根抑制效果,LY83583也抑制CTX对Co1-0插条不定根发生的促进效应。SNP对δ-FlincG转基因拟南芥胚轴中cGMP表达水平有促进并沿胚轴向插条上部传导的作用,同时c-PTIO、Na2WO4可以显著抑制这个效应,但是8-Br-cGMP、LY83583无法影响Col-0插条中内源NO水平,同时发现8-Br-cGMP可以逆转阻遏NO积累导致的插条不定根抑制作用,但SNP并不能解除LY83583对不定根的抑制效应。这些结果说明在拟南芥插条中Gα位于系统信号NO、cGMP的上游,而cGMP则在NO的下游起作用。8、CTX使切后5h左右的DR5rev::G