蜡状芽孢杆菌β-CGTase发酵、基因克隆表达及其酶学性质研究

作     者：凌国庆 

作者单位：合肥工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张洪斌

授予年度：2012年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：β-CGTase 诱变 分离纯化 酶学性质 克隆 

摘      要：β-CGTase因为其广泛的应用价值，特别是在生产β-CD和药物分子修饰等方面有着巨大的前景。 论文首先筛选得到一株高产β-CGTase的菌株，然后对菌株进行了鉴定，确定为是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。以该蜡状芽孢杆菌BC-0801为出发菌株，利用10keV，剂量为40×2.5×10ions/cm氮离子进行诱变选育，获得一株高产β-CGTase的菌株BC0802。然后对菌株的发酵条件进行优化，其最适培养基为：玉米粉3%，玉米浆1%，蛋白胨1%，酵母浸膏1.5%，K2HPO40.05%、MgSO·7HO0.01%;最适发酵pH为9.0，接种量为4%，发酵时间为36h，发酵温度为30℃。 在获取最佳产酶条件的基础上，从发酵液中提取粗酶液，再经过硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-150分离得到β-CGTase纯品。经SDS-PAGE测得酶的分子量为75kDa，Km=2.8153g/L;酶的最适温度为60℃，最适pH为7.0，Ca对酶活有较大的促进作用，Mg、Al3+、Zn、Fe、Fe3+、Mn、Co、SDS对酶均有较强的抑制作用。 其次，通过分子生物学手段，对蜡状芽孢杆β-CGTase的基因进行了克隆，构建了温控型表达载体，转化大肠杆菌DH5α，最终实现了表达。工程菌的最佳诱导条件为：菌浓OD600为1.0，诱导时间为4h，起始培养基的培养温度为30℃，pH为8.0。诱导温度的分配为39℃，2h，41℃，1h，42℃，1h。从工程菌株体内提取粗酶液，再通过硫酸铵盐析、透析、Sephadex G-150凝胶分离得到较纯的β-CGTase。经SDS-PAGE测定该重组酶的分子量为85kDa，Km值为2.4508g/L，最适温度为65℃,且该酶较耐高温，在90℃条件下，4h后酶活才会显著下降50%，在100℃下经过2h后酶活才会显著下降70%，最适pH为9.0。脲和Ca和Fe对酶活具有一定的促进作用，Mg、Zn、Tris、Co等对酶有很强的抑制作用。 将β-CGTase分别构建在以大肠杆菌DH5α为宿主的pET28质粒和以枯草芽孢杆菌为宿主的pAX01质粒上。且β-CGTase在这两株工程菌体内均实现了表达。 通过对蜡状芽孢杆菌产β-CGTase从菌株筛选、诱变到发酵条件优化，再到分子生物学研究，获得了一株高产β-CGTase的蜡状芽孢杆菌突变菌株和一株高产嗜热β-CGTase的工程菌株，建立了一个系统的研究方法，为将来的工业化生产奠定了一定的基础。