pPB多肽介导的肝纤维化靶向siRNA稳定核酸脂质纳米粒研究

作     者：皮玉芳 

作者单位：华东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王依婷

授予年度：2016年

学科分类：100702[医学-药剂学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：肝纤维化 稳定核酸脂质纳米粒 siRNA pPB多肽介导 靶向治疗 

摘      要：肝纤维化是肝脏疾病发展至肝硬化及其并发症的唯一途径,对人类的健康产生严重的威胁。阻断肝纤维化的发生和发展对肝脏疾病的治疗具有重要意义。小干扰RNA(siRNA)已经被证实能够有效地下调人类相关基因的表达,从而使因高表达基因引起的疾病恢复正常,具有基因药物开发的巨大潜力。构建合适的递送系统解决siRNA在体内的递障碍,是开发siRNA基因药物中的一个关键性环节。本文旨在构建靶向肝纤维化治疗的siRNA稳定核酸脂质纳米粒递送系统,以开发siRNA基因药物作为最终目标,对于靶向治疗肝纤维化的相关siRNA药物的开发具有指导意义。在针对肝纤维化的siRNA的选择中,考虑到HSP47(热休克蛋白基因,鼠中的同源基因为gp46的高表达在肝纤维化的发生和发展中起着很重要的作用,设计同时沉默HSP47/gp46的3条siRNA序列用于针对肝纤维化的基因治疗药物进行筛选。本课题利用siRNA转染NIH3T3细胞和QPCR实验筛选出对gp46抑制效果明显的siRNA,实验结果得出3条siRNA对gp46基因沉默效率分别是:siRNA165.5%,siRNA264.6%,siRNA316.6%。故选用沉默效率较高的 siRNA1和siRNA2分别作为基因药物治疗成分,进行后续递送系统的建立研究。在siRNA的脂质递送系统的构建中,利用siRNA与阳离子脂质DlinMC3及其辅助脂质DSPC、Chol、PEG-DMG制备了稳定核酸脂质纳米粒(Stable nucleic acid lipid nanoparticles,SNALP)。为了实现对肝脏纤维化疾病的主动靶向治疗,在SNALP的基础上引入pPB多肽,pPB多肽通过特异性识别活化的肝细胞上过量表达的PDGF-β而实现对肝脏的主动靶向性。将pPB多肽与脂质PEG-DSPE连接合成pPB-PEG-DSPE靶向脂质分子,可以作为SNALP制备过程中的靶向脂质成分使用。利用siRNA、靶向脂质分子pPB-PEG-DSPE和SNALP的其他脂质成分DlinMC3、DSPC、Chol、PEG-DMG以一定配比制备出具有肝脏靶向性的稳定核酸脂质纳米粒pPB-SNALP。对制备的SNALP和pPB-SNALP进行物理参数如粒径(流体动力学半径,Rh)、多分散系数(PDI)和表面电荷(Zeta potential)表征的结果为:Rh为110-130nm,PDI 为 0.1-0.3,Zeta potential 在 0 左右。表明 SNALP 和 pPB-SNALP 的粒径分布均一且表面电荷呈电中性,物理性质稳定。建立基因高表达模型和肝纤维化模型,并通过基因高表达模型对pPB-SNALP和SNALP进行治疗效果验证,对基因高表达的昆明小鼠尾静脉注射0.023mg/kg(siRNA浓度)的pPB-SNALP和SNALP,总结QPCR实验结果得到:1)pPB-SNALP/siRNA1组的gp46基因沉默效率为37%。SNALP/siRNA1组的基因沉默效率为12%。2)pPB-SNALP/siRNA2组的基因沉默效率为29%,SNALP/siRNA2的基因沉默效率为13%。结果表明在gp46基因高表达动物模型中,pPB-SNALP和SNALP都起到抑制gp46基因表达的效果,pPB-SNALP比SNALP的基因效果更加显著,即pPB-SNALP中pPB多肽的介导实现了对肝纤维化治疗的主动靶向性,为肝纤维化的靶向治疗提供新的思路。综上所述,本课题成功构建了靶向肝纤维化的HSP47/gp46 siRNA稳定核酸脂质纳米递送系统pPB-SNALP,并分别在体内和体外进行了靶向性验证和治疗效果验证,为针对肝纤维化的靶向基因治疗提供了新的思路。