人源化CDR3δ1移植性抗体杀伤肝癌的研究和SLE、RA患者和健康人CCT5蛋白水平的观察

作     者：高运安 

作者单位：北京协和医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：何维

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：人源化抗体 外周血单核淋巴细胞 CCT 自身免疫疾病 

摘      要：丫δT淋巴细胞属于T淋巴细胞的一种小亚群,主要分布于皮肤、小肠、肺等的粘膜组织中,它的主要作用是识别并杀伤感染细胞及异常细胞,参与机体的免疫调节,从而增强其非特异性免疫防御功能。研究表明,肿瘤浸润的γδT淋巴细胞具有直接识别并杀伤肿瘤细胞的作用;其杀伤机制是γδT淋巴细胞通过其表面的T细胞受体（γδ T cell receptor,γδ TCR）特异地识别肿瘤抗原,进而杀伤肿瘤细胞。本课题组在前期工作中,重点研究了TCRδ链V区中互补决定区3（CDR3δ）的抗原表位结合功能,并依此构建CDR3δ移植性人源化抗体,以期为肿瘤治疗性抗体研发与应用提供具有yδTCR的靶向抗体,我们从三例胃癌肿瘤浸润γδT淋巴细胞中筛选出了一个优势CDR3δ1序列,命名为GTM;然后,通过基因重组技术得到用GTM序列取代TCRδ1CDR3的人源化CDR3移植性抗体TCRγ4δ1（GTM）-Fc,命名为GTM-Fc,另外,还构建了另一个从卵巢上皮癌肿瘤浸润γδT淋巴细胞中获得的优势序列δ2CDR3（OT3）取代TCRδ2CDR3的人源化CDR3移植性抗体CRy9δ2-Fc,命名为OT3-Fc。 前期实验表明,OT3-Fc能够促进外周血单个核淋巴细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）对卵巢癌细胞AKOV3和ES-2的杀伤作用,荷瘤裸鼠体内实验也证明了OT3-Fc的这种促杀伤能力。此外,除了卵巢癌之外,OT3-Fc还能与其他多种癌细胞系发生结合,这提示其对肿瘤的识别具广谱性。由于GTM-Fc和OT3-Fc两种人源化抗体均保留了TCRγδ的抗原识别特异性,姜燕博士已经证明人工合成的GTM肽对不同肿瘤细胞系,包括BGC-823、G401、GLC-82、HT29和SKOV3等细胞及不同肿瘤组织,包括胃癌、肾癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌等组织均有不同程度的结合;同时,GTM-Fc抗体也具有Fc段介导的效应,因此,我们推测GTM-Fc也具有OT3-Fc相类似的杀伤肿瘤的功能。它们都可能成为肿瘤靶向治疗的理想候选者。肝癌是目前最常见和死亡率极高的恶性肿瘤之一,目前临床上对肝癌的治疗手段包括手术、化疗、放疗及生物治疗等,其中生物治疗作为一种新兴的治疗方法,在对肝癌常规治疗方法的辅助上,具有重要作用。 生物治疗中的抗体治疗可分为多克隆抗体和单克隆抗体治疗,多克隆抗体治疗其特异性较差,很容易产生副作用,因此在临床上应用并不广泛。而单克隆抗体具有纯度高、效价高、特异性强以及交义反应少等优点.在对肿瘤的临床治疗上具有重要作用。二十多年来,临床上批准使用的治疗性单抗药物已多达数十种.但针对肝癌进行治疗的的单抗只有抗甲胎蛋白（alpha fetal protein, AFP）抗体、贝伐抗体及抗铁蛋白抗体等少数几种,寻找更多的能够对肝癌进行治疗的单克隆抗体,在临床上具有重要意义。 本文分为两部分,第一部分,旨在研究GTM-Fc和OT3-Fc两种人源化移植性抗体作为单抗药物治疗肝癌的可能性,从而为抗体靶向治疗肝癌提供新的策略。首先,我们通过流式细胞术（Flow cytomery, FCM）检测GTM-Fc和OT3-Fc移植性抗体与三种肝脏癌细胞HepG2、Hep3b及HepG2.2.15的结合能力。流式结果显示,GTM-Fc与三种肝癌细胞系均有不同程度的结合;而OT3-Fc与HepG2细胞不发生结合,与其余两种肝癌细胞有结合,但是结合程度都比GTM-Fc要低。因此,我们采用GTM-Fc作为目标抗体进行后续研究。 在证实了GTM-Fc与肝癌细胞的结合能力之后,分别通过体外细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-ADCC）和体内HepG2.2.15荷癌裸鼠抑瘤实验来研究GTM-Fc对PBMC杀伤肝癌细胞的影响。结果表明,GTM-Fc在体外能够促进PBMC对三种肝癌细胞的杀伤作用,并且在荷瘤裸鼠模型中能够增强PBMC对HepG2.2.15移植瘤的抑制作用。因此,GTM-Fc有望作为候选治疗性单抗,用于肝癌的生物治疗。 自身免疫性疾病（Autoimmune disease, AID）是一类由于自身免疫反应发生紊乱而导致机体损伤的疾病,包括系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）、甲状腺功能亢进以及慢性淋巴性甲状腺炎（chronic lymphocytic thyroiditis, CLT）等。 本实验室前期工作中,从人肾组织来源的HK-2细胞上分离出了能被SLE病人中γδT淋巴细胞优势表达的TCRδ2CDR3序列识别并结合的配体蛋白,然后通过质谱分析技术,鉴定出该配体蛋白为伴侣素家族的成员（Chaperonin containing T-complex polypeptide-1, zeta亚基,CCT5）,提示CCT5蛋白可能属于γδT淋巴细胞受体（γδ）TCR)的配体分子之一。有研究表明,在某些AID中,γST淋巴细胞数量及克隆表达的异常,提示它可能参与这些疾病的发生发展过程。CCT5作为γδTCR的候选配体分子,在AID中可能也会发生变化。了解CCT5在AID中的变化,有助于研究γδT淋巴细胞在AID中所起到的作用;同时,也可能为临床上诊断或研究AID提供新的靶标。 所以,本文的第二部分,旨在对健康人、SLE及RA病人三个群体体内的CCT5含量进行比较研究。我们主要采用酶联免疫吸附剂试验（Enzyme linked immune sorbent assay, ELISA）来检测健康人、RA病人及SLE病人中CCT5的含量并进行群体间的比较观察。结果显示,三个群体的血清中CCT5阳性率及CCT5浓度范围有所区别,健康人和SLE或RA病人相比,CCT5阳性率更高,达到43.75%,并且CCT5的浓度高;而SLE和RA病人中的CCT5阳性率均低于20%,同时CCT5浓度不高。RA及SLE病人体内与健康人相比,CCT5阳性率和含量的显著差异提示,CCT5有望作为新的生物标志分子,用于辅助SLE和RA的临床诊断。 综上所述,本文的主要结论为： 1.人源化的CDR3移植性抗体GTM-Fc在体外均能与三种肝癌细胞系HepG2、 Hep3b、HepG2.2.15发生结合,且比OT3-Fc与肝癌细胞的结合能力更强。GTM-Fc能够促进PBMC对三种肝癌细胞的杀伤作用,在荷瘤的Balb/c裸鼠体内,GTM-Fc能促进PBMC对人移植HepG2.2.15肝癌的抑制作用,表明GTM-Fc有可能作为候选治疗性单抗用于肝癌进行治疗,其识别癌细胞的功能由γδSTCR CDR3决定。 2.健康人的CCT5表达阳性率及表达量均显著高于SLE或RA病人;而SLE和RA病人的CCT5阳性率及表达量无显著差异。提示CCT5可作为诊断SLE和RA疾病的辅助诊断的生物标志分子。