抑胶素对胶质瘤细胞抑制作用的体外实验研究

作     者：谢晓娜 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马涤辉;林卫红

授予年度：2004年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：抑胶素 C6胶质瘤细胞 光镜 电镜 免疫组化 p16蛋白 

摘      要：脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，多呈侵袭性生长，与脑组织无明显的界限，手术难于彻底切除，而且术后极容易复发，因此，化疗在临床是一种很重要的治疗方法，但是，临床上所用的化疗药物由于毒副作用较大，而且容易产生耐药性，因此，寻找对其敏感的药物具有极重要的意义。 抑胶素是一种正在研制的新的抗胶质瘤药物。本论文的目的是：1、通过体外实验观察抑胶素对C6胶质瘤细胞生长增殖的抑制作用，对比观察用药前后肿瘤细胞在光镜以及电镜下的形态学变化。2、用免疫组化的方法检测用药前后细胞周期调控蛋白p16表达的变化。3、根据以上实验结果初步探讨抑胶素抗胶质瘤作用的可能机制，为其应用于临床提供理论依据。 首先，我们利用GFAP对培养的胶质瘤细胞进行鉴定。通过免疫组化方法，检测肿瘤细胞GFAP的表达，结果，肿瘤细胞的胞浆中可见棕黄色的颗粒，GFAP表达明显阳性。从而明确实验所用的细胞是胶质瘤细胞。 抑胶素对C6胶质瘤细胞生长增殖的抑制作用 在这部分实验中，我们在传代培养C6胶质瘤细胞的基础上，将细胞分为对照组、抑胶素处理组和顺铂处理组同时进行研究。细胞贴壁后，抑胶素处理组的药物浓度分别为2、4、8、16ng/L，顺铂处理组的药物浓度为3μg/mL，而对照组不加入药物。于用药后1d、3d、5d分别留取标本，观察光镜以及电镜下肿瘤细胞形态学的变化，并且用MTT法测定肿瘤抑制率。 实验结果显示：用抑胶素处理后肿瘤细胞的形态发生了明显的改变。倒置显微镜下可见，对照组细胞贴壁状况良好，铺满瓶底。细胞均质而透明，呈扁平不规则的多边形，单层密集排列，细胞大小、形态表现出多样性，以梭形细胞及有相对较大的细胞核的小圆细胞较为多见，胞质丰富，细胞间粘连完好，相互接壤成片。而实验组细胞数目减少，排列稀疏，细胞贴壁状况不好，细胞膜完整，细胞体积变小，收缩变圆，轮廓更加清楚，同时可有皱缩变形。电镜下可见，对照组细胞形态不规则，突触发达，细胞表面可见微绒毛结构，细胞核亦不规整，核内异染质较多，细胞质内可见到许多细胞器，如线粒体，粗面内质网及游离核糖体等结构。实验组细胞突触减少，微绒毛消失，细胞核极不规则，核固缩明显，可见细胞核有切迹，核内异染色质凝集增多，细胞质内多数线粒体肿胀、空化，线粒体嵴断裂，内质网扩张，同时有一些髓样小体出现。 MTT法的实验结果显示：抑胶素能明显抑制C6胶质瘤细胞的生长，而且随着抑胶素浓度的增大，其对肿瘤细胞的抑制率也增加。一般当药物对肿瘤生长抑制率为30％以上时，认为其对肿瘤的增殖有明显的抑制作用，本实验中，抑胶素在32ng/L剂量时即能明显的抑制肿瘤细胞的生长，随着药物浓度的提高，其抑制率可达54.83%，充分说明了抑胶素对C6胶质瘤细胞的增殖具有抑制作用。 抑胶素对细胞周期调控基因p16基因蛋白表达的影响 p16基因又称为多瘤抑制基因（multiple suppressor gene, MST），定位于染色体9P21，是直接作用于细胞周期的重要的抑癌基因，编码负性调控细胞周期的p16蛋白，作为CDK4的抑制因 子，能够抑制细胞的分裂。在多种肿瘤细胞以及临床肿瘤标本中，p16基因都有着高频率的缺失及突变，尤其以脑胶质瘤细胞系为最高，达到82％，显示了它在脑胶质瘤恶性转化中的重要作用。有研究表明，p16蛋白与多种恶性肿瘤的发生密切相关，而且可能与肿瘤的某些生物学行为及预后有关。 本实验研究了不同浓度的抑胶素处理后1d，3d，C6胶质瘤细胞p16基因蛋白的表达。结果显示：对照组肿瘤细胞的p16蛋白表达明显缺失，而实验组细胞p16蛋白表达明显增多，细胞浆或细胞核内可见棕黄色颗粒，二者对比有明显的统计学差异。 本实验结论：抑胶素对C6胶质瘤细胞的生长增值有明显的抑制作用，其作用的可能机制是诱导肿瘤细胞调亡及改变肿瘤细胞增殖周期，为该药的临床开发提供了理论依据。