以DHCR24为靶点的新型降胆固醇药物的筛选及药效的初步研究

作     者：赵琳琳 

作者单位：辽宁大学 

学位级别：硕士

导师姓名：芦秀丽

授予年度：2017年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：胆固醇 24-脱氢胆固醇还原酶 虚拟筛选 老药新用 分子模拟 

摘      要：人体内胆固醇含量过高会引起许多疾病,尤其是心血管疾病。胆固醇主要由内源性合成而来,占总体的80%。内源性合成的最后一步反应为链甾醇还原为胆固醇,催化此反应的酶为DHCR24(3β-脱氢胆固醇-Δ24还原酶)。DHCR24基因的突变(单点突变E191K、N294T、K306N、Y471S和两点突变N294T/K306N)会导致酶活性降低,从而使细胞胆固醇的含量下降。本实验研究以DHCR24蛋白为靶点,以期寻找到通过抑制DHCR24酶活性从而降低细胞胆固醇的新型降胆固醇药物。传统的药物筛选研发成本高并且周期很长,本研究利用计算机虚拟筛选联合细胞平台筛选技术,以达到节约时间和成本,并且提高筛选阳性率的目的。此外,本研究选用现有药物小分子数据库,可以提高候选药物的安全性,进一步为研发药物节约时间与成本,提高筛选效率。本实验首先通过同源建模和分子动力学技术建立、优化并确定DHCR24蛋白结构模型。然后利用分子对接及虚拟筛选技术,在DrugBank数据库中进行初步筛选,得到可能能够竞争性抑制DHCR24与底物desmosterol结合的小分子药物,选取其中打分最优的50个现有药物小分子候选药物。接下来对这50个候选药物进行AutoDock 4精确对接,并进行聚类分析。然后根据其易获得性进行进一步筛选,最终确定了4个候选药物(OND1,OND2,OND3,OND4)。我们利用人肝癌细胞株HepG2细胞培养平台联合高效液相色谱法(HPLC),验证筛选出的4种药物抑制DHCR24酶活性从而降低细胞胆固醇含量的效果。实验结果证明,这四种药物组以及一组阳性对照组U18666A(已知的DHCR24抑制剂)在给定剂量下都能显著降低细胞胆固醇的含量,初步证明了虚拟筛选结果的准确性。接下来,我们利用固醇荧光染色法(非律平)再次验证四种小分子药物的降胆固醇效果。结果显示四种药物降胆固醇的效果均非常显著。最后,我们利用分子动力学模拟的方法,对四种候选药物抑制DHCR24酶活性的具体机制进行了初步研究。综上,本研究发现了四种新型DHCR24抑制剂,并经过初步的细胞水平实验,证明其有降低细胞胆固醇的效果,为将其进一步开发为以DHCR24为靶点的新型降胆固醇药物奠定了坚实的基础。本研究的完成为以DHCR24为靶点开发新型降胆固醇药物提供了新的思路。