多功能纳米微球特异性检测牙龈卟啉单胞菌的实验研究

作     者：秦尉 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王永兰

授予年度：2017年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：牙周炎 上转换编码微球 磁编码微球 牙龈卟啉单胞菌 口腔细菌 

摘      要：目的分别通过高温油相法和化学共沉淀法制备上转换纳米粒子和磁纳米粒子,然后对这两种纳米粒子进行改性以更好的与牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体结合,从而达到富集并识别混合菌液中牙龈卟啉单胞菌的目的。本研究旨在为上转换纳米材料和磁纳米材料在口腔检测及诊断领域的应用提供一个新的思路,同时为进一步行多种牙周致病因子的同时检测提供研究基础。方法1.使用高温有机溶剂法制备绿色上转换纳米粒子(NaYF:Er Yb);通过透射电镜(TEM)表征NaYF:Er Yb纳米粒的形貌;使用荧光光谱仪表征NaYF:Er Yb的光谱;Zeta电位及粒度分析仪分别表征NaYF:Er Yb的晶体结构和表面电荷。2.采用化学共沉淀法制备磁纳米粒子(FeO);通过TEM表征FeO的形貌;使用振动样品磁强计(VSM)来评估FeO的磁强度。3.使用二氧化硅包裹Na YF:Er Yb纳米粒子和FeO纳米粒子分别制得两种纳米微球(NaYF:Er@SiO和FeO@SiO);通过TEM表征两种纳米微球的形貌;使用荧光光谱仪表征NaYF:Er@SiO的光谱;使用VSM来评估FeO@SiO的磁强度。4.探究NaYF:Er@SiO和FeO@SiO的非特异性吸附作用;使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来活化SiO纳米微球后结合抗体,之后与牙龈卟啉单胞菌反应,然后与活化后未结合抗体的微球与牙龈卟啉单胞菌反应作对比;使用外置980nm NIR激发器的荧光显微镜观察两组反应结果。5.验证牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体的特异性;活化NaYF:Er@SiO后与牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体结合,然后分别与牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌及变形链球菌混合,同时设置空白对照组,仅在磷酸盐液中加入已结合抗体的NaYF:Er@SiO;使用外置980nm NIR激发器的荧光显微镜观察反应结果。6.混合菌液中检测牙龈卟啉单胞菌;将结合牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体的NaYF:Er@SiO和FeO@SiO加入含有牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、变形链球菌及中间普氏菌的混合菌液中;使用外置980nm NIR激发器的荧光显微镜观察反应结果。7.评价检测系统的灵敏性;调节牙龈卟啉单胞菌菌液的浓度(105,104,103,102,10和0 CFU/mL)分别加入结合牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体的NaYF:Er@SiO和FeO@SiO纳米微球,离心洗涤后使用外置980nm NIR激发器的荧光显微镜观察反应结果。结果***:Er Yb纳米粒子和NaYF:Er@SiO纳米微球的理化性状观察:透射电镜下可见NaYF:Er Yb纳米粒子和NaYF:Er@SiO纳米微球的分散性较好,大小均一,NaYF:Er Yb的平均粒径约为30 nm,NaYF:Er@SiO的平均粒径约为100 nm。荧光光谱显示,在519 nm、542 nm和655 nm处可见明显的3个吸收峰,且NaYF:Er@Si O的波峰强度较NaYF:Er Yb并未明显降低。***纳米粒子和FeO@SiO纳米微球的理化特性观察:透射电镜下可见FeO纳米粒子和FeO@SiO纳米微球分散性较好比较均匀,FeO的形貌为不规则的球形,平均粒径约为7 nm,FeO@SiO为规则的球形,平均粒径为50 nm。常温下磁滞回力曲线显示,包硅后FeO纳米粒子的磁强度未发生明显改变。3.荧光显微镜下可见经EDC/NHS活化后结合抗体的纳米微球组在980nm NIR激发下可见绿色荧光,而EDC/NHS活化后未结合抗体的纳米微球组在980nm NIR激发下未见任何绿色荧光。4.荧光显微镜下可见经980nm NIR激发下,除牙龈卟啉单胞菌组外,空白对照组、具核梭杆菌组及变形链球菌组均无绿色荧光。5.将结合牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体的NaYF:Er@SiO和FeO@SiO加入至混合菌液中,反应后洗涤分离经980nm NIR激发后荧光显微镜下可见绿色荧光。6.除空白组外,梯度浓度的牙龈卟啉单胞菌菌液加入NaYF:Er@SiO-Ab和FeO@SiO-Ab后离心洗涤,使用外置980nm NIR激发器的荧光显微镜均可发现绿色荧光。结论1.使用高温有机溶剂法制备绿色上转换纳米粒子理化性状良好,包硅改性后并不会明显改变其荧光强度,且分散性良好,大小均匀。2.使用化学共沉淀法制备磁纳米粒子磁强度良好,包硅改性后并不会明显改变其磁强度,且分散性良好,大小均匀。3.未结合抗体的情况下,上转换纳米微球和磁纳米微球并不会吸附细菌,即无非特异性吸附作用。4.使用本研究所建立的检测系统可在10 CFU/mL的牙龈卟啉单胞菌菌液中检测出牙龈卟啉单胞菌,说明该检测系统检测灵敏性良好。