去甲斑蝥素对激素非依赖前列腺癌DU145细胞作用及其作用机制的研究

作     者：陈三三 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谭万龙

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：前列腺癌 去甲斑蝥素 DNA复制 cdc6 ATR 有丝分裂灾变 紫杉醇 

摘      要：研究背景 前列腺癌是欧美国家男性常见的恶性肿瘤,发病率居所有恶性肿瘤的第二位。最新的资料显示,美国2010年前列腺癌新发病例为217730例,占所有肿瘤的28%;2010年美国有32050人死于前列腺癌,占所有因肿瘤死亡者的11%。我国前列腺癌的发病率远低于西方国家,但由于生活方式西化、人口老龄化及前列腺特异抗原(PSA)筛查的普及,近10年来前列腺癌的发病率呈直线上升的态势,前列腺癌的发病率及死亡率显著上升,已成为影响中国男性健康的重要疾病之一,应受到更多的重视。 早期局限性前列腺癌一般采用手术或局部放疗,对于晚期前列腺癌,内分泌治疗是多年来公认的有效治疗方法。在内分泌治疗开始阶段,绝大多数患者可以达到肿瘤缩小,血清前列腺特异性抗原(prostate specific antigen, PSA)下降,骨痛减轻,尿路梗阻和出血症状缓解,体力状况改善。但是,相当一部分患者在内分泌治疗中位时间14～30个月后,前列腺癌从对激素依赖逐渐变为对激素不敏感,成为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。CRPC一旦出现,治疗就比较困难,且严重威胁患者的生命。在去势抵抗性前列腺癌中,化疗占有重要的地位。目前,以多西紫杉醇为基础的化疗已经成为一线的化疗方案。紫杉醇类药物的主要作用机制是在G2/M期抑制微管解聚,导致肿瘤细胞有丝分裂障碍,使肿瘤细胞周期阻滞在M期。研究表明,多西紫杉醇在三期实验中对病人生存期有益处,而且能够减少患者疼痛、提高患者的生活质量。多西紫杉醇的主要副作用是嗜中性白血球减少症、骨髓抑制等,这些副作用限制了对老年体弱的晚期前列腺癌患者应用。非常遗憾的是,相当一部分去势抵抗性前列腺癌患者对多西紫杉醇无反应,而且几乎所有的去势抵抗性前列腺癌患者都最终发生药物抵抗。那么找到一种对骨髓抑制小,甚至能升高白细胞的抗肿瘤药物作为辅助或者联合紫杉醇类药物治疗前列腺癌,以减少紫杉醇类药物的副作用,减少其耐药性,可能优化为去势抵抗性前列腺癌的化疗。 去甲斑蝥素(Norcantharidin,简称NCTD)是斑蝥素的衍生物,是我国自主研发的抗肿瘤药物,与斑蝥素构型相似,唯1、2位无甲基。去除两个甲基后,NCTD的泌尿系刺激作用基本消失,而且保留了抗癌活性。NCTD目前临床主要用于治疗原发性肝癌、食道癌、胃癌、乙型肝炎以及银屑病等。NCTD的抗肿瘤作用有其独到的优点。研究表明,NCTD相比其他的化疗药物,其骨髓抑制作用较小,而且有升高白细胞的功能。NCTD的这些优点正好弥补多西紫杉醇造成的副作用缺陷。此外,现有研究表明,NCTD的抗肿瘤作用途径的多样性,可能延缓肿瘤耐药的发生,其作用主要有：1、NCTD抑制肿瘤细胞DNA复制,且随着NCTD浓度的增加抑制率逐渐增加;2、NCTD可诱导肿瘤细胞Cdc6蛋白的降解,Cdc6蛋白是起始DNA复制所必须的调节蛋白,NCTD可能通过抑制Cdc6蛋白而抑制肿瘤细胞DNA的复制;3、NCTD可以诱导多种肿瘤细胞凋亡,NCTD诱导肿瘤细胞凋亡的过程中伴有Caspase的活化、Bcl-2和Bcl-xl蛋白的功能调节。近期的研究表明,NCTD诱导肿瘤细胞凋亡受到细胞内MAPK激酶通路的调节,凋亡伴有JNK途径的活化。发现在NCTD诱导的HeLa细胞凋亡过程中ERK和JNK的激活发挥了重要作用。 前复制复合体(pre-replication Complex,简称pre-RC)是真核细胞起始DNA复制所必须的调控因子,包括Orc、Cdc6、Cdtl和Mcm2-7,其中Cdc6(cell division cycle6homolog)蛋白具有癌基因的功能,可促进细胞的恶性转化,通过抑制Cdc6可以产生抗肿瘤作用。Cdc6已经被证实可作为有效的抗肿瘤靶点。首先,Cdc6在多种肿瘤组织中高表达,而在正常细胞中表达极低或没有表达,而且其表达与组织的恶性增生进程相关。其次,一些诱导细胞凋亡的因素,如：射线照射、TNF以及一些抗肿瘤药物可抑制Cdc6蛋白。另外,通过RNA干扰的方法抑制Cdc6,可以诱导肿瘤细胞凋亡。有研究结果表明,NCTD可以导致DNA复制起始蛋白Cdc6的裂解。在哺乳动物包括人的细胞中,Cdc6蛋白在两方面发挥功能。一方面,在G1期参与起始DNA的复制。真核细胞DNA复制的起始需要一个被称为“复制前复合体(pre-replication Complex,简称pre-RC)的组装,即pre-RC中的蛋白组分先后被招募到DNA复制起始位点,一起构成pre-RC后才能起始DNA的复制。在G1期这个“复制前复合体的组装最为重要的一环就是Cdc6与DNA复制起始位点的结合,然后才能启动后续Mcms才能结合于染色体上完成pre-RC的组装。如果Cdc6功能被抑制,细胞将不能完成pre-RC的组装,DNA复制