红酵母降解中国黄酒中氨基甲酸乙酯的研究

作     者：赵雅敏 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐岩

授予年度：2012年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 083203[工学-农产品加工及贮藏工程] 

主      题：黄酒 氨基甲酸乙酯 降解 氨基甲酸乙酯降解酶 红酵母 

摘      要：氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，简称EC)是发酵食品与酒精饮品发酵及贮存过程中天然产生的污染物。过去曾被用于人类医药用途，但因为含有毒性且疗效欠佳，现已禁用。2007年，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)正式将其从2B类致癌物上升为2A级别，与丙烯酰胺同等危险。作为我国特有的传统饮用酒，黄酒中EC含量超标的问题越来越受到人们的关注，基于现有方法无法完全解决黄酒中EC污染问题，探索和建立新的EC控制方法及其在中国黄酒中实际应用的研究具有重要理论依据与现实价值。 本论文研究内容涉及EC降解菌株的分离筛选、摇瓶发酵产酶条件的初步优化、该菌株所产EC降解酶的初步研究以及游离细胞及固定化细胞在黄酒中EC去除方面的应用。主要研究结果如下： 1)以酒曲、酒醅、土壤等材料为分离源，通过以EC为唯一碳源的筛选培养基筛选获得一株具有EC降解能力的菌株LBMAE-8，当培养基中EC初始浓度为5g·L，培养时间为6d时，EC降解率可达80%;通过生理生化性质考察结合26S rDNA测序鉴定其为红酵母属(Rhodotorula sp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：5081。该酵母来源于中国白酒大曲，且红酵母通常被认为是安全的，故初步认为其可应用于中国黄酒中EC的去除。 2)采用单因素实验对LBMAE-8摇瓶发酵产酶条件进行了优化，确定实验条件下500mL三角瓶最适产酶条件为：葡萄糖20g·L，酵母膏30g·L，MnSO41.4mmol·L，培养基初始pH6.0，装液量75mL，发酵温度30℃，接种量4.0%，发酵时间42h，优化后酶活力达421.6U·g干菌，比优化前提高3.52倍。 3)对菌株LBMAE-8所产EC降解酶进行了初步研究。初步判断其为组成型酶;降解EC产物为氨、乙醇与二氧化碳;经过离子交换层析、疏水层析以及凝胶过滤三步柱层析，得到初步纯化的酶，比活力提高33.1倍，酶活回收率为3.0%。经过初步纯化的酶最适反应温度为40℃，最适反应pH为中性，酸性条件下酶活力损失严重，说明游离酶不适合直接应用于实际酒精饮品中，微生物全细胞、固定化细胞或者固定化酶的方式是可选途径。研究结果为后续研究工作提供了一定的借鉴意义。 4)通过游离细胞及固定化细胞证明了LBMAE-8在中国黄酒中EC去除方面的应用价值。LBMAE-8全细胞对乙醇及酸有一定的耐受性，对两种市售实际黄酒中EC的去除率可达39.68%与19.01%;对该菌进行细胞固定化处理，经过比较，海藻酸钙包埋法与壳聚糖/海藻酸钙微胶囊(一步法)法制得的固定化细胞的酶活回收率较高。在加酶量相同的情况下，一步法制备的壳聚糖/海藻酸钙微胶囊固定化细胞使一实际酒样中EC的去除率从游离细胞的不足5%提高到50%左右。