儿童肠息肉相关肿瘤基因的表达及其表现遗传修饰

作     者：程海英 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：江米足

授予年度：2011年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：大肠息肉 肿瘤相关基因 表观遗传学 DNA甲基化 组蛋白修饰 儿童 

摘      要：研究背景： 肠息肉是引起儿童便血的最常见原因之一,其中幼年性息肉是儿童期最常见的病理类型,发生机制尚不明确,大多数学者认为其预后良好,但仍有一定的复发风险和恶变潜能。近年来,遗传学和表观遗传学机制在肿瘤发生、发展中的作用逐渐受到重视。对成人的研究表明,由于基因突变等原因,肠干细胞中β-catenin过度积聚,使肠干细胞自我更新、克隆增殖和分化的速度超过正常肠上皮组织细胞凋亡的速度,导致肠上皮组织细胞不断扩增并超过邻近的正常肠隐窝,形成肠息肉。而细胞信号转导通路中的Wnt信号通路、PTEN信号通路和BMP信号通路,共同调节肠干细胞中β-catenin水平,使肠上皮细胞的更新和凋亡处于动态平衡,从而控制肠道上皮细胞再生和正常发育的过程。APC是肿瘤抑制基因,也是经典的Wnt通路的阻滞剂;PTEN是磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)信号通路抑制剂,与Wnt通路共同调节细胞的更新和凋亡速度。但对儿童最常见的大肠幼年性息肉,尚未见相应抑癌基因APC、PTEN突变的报导。 表观遗传修饰如DNA甲基化、组蛋白乙酰化也是目前肿瘤领域研究的热点。在成人结直肠癌中,许多基因启动子区域CpG岛的甲基化已成为肿瘤检测、治疗和预后评价的分子标记。而组蛋白乙酰化状态由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)调节。HATs和HDACs之间的动态平衡控制着染色质的结构和基因的表达,它们的功能紊乱是肿瘤发生发展的重要分子机制。但在儿童幼年性息肉的发生中是否也存在着APC基因启动子甲基化的改变,以及组蛋白HATs和HDACs功能紊乱目前尚不清楚。 目的： 通过检测儿童大肠幼年性息肉、息肉蒂部黏膜及正常大肠黏膜组织中的抑癌基因APC、PTEN和癌基因β-catenin的mRNA和蛋白水平的表达,及息肉组织APC基因启动子甲基化状态、乙酰转移酶和去乙酰化酶表达的差异,探讨儿童肠息肉中相关肿瘤基因APC、PTEN及β-catenin的表达及表观遗传修饰变化,试图阐明儿童肠息肉形成的发病机制,为寻找新的防治策略提供理论依据。 方法： 留取本院经电子结肠镜检查确诊并切除的新鲜息肉组织、息肉蒂部黏膜和同期结肠镜检查正常的大肠黏膜组织,应用RT-PCR技术检测儿童大肠息肉、息肉蒂部黏膜及正常大肠黏膜组织中的抑癌基因APC、PTEN和癌基因β-catenin及乙酰转移酶(CBP、PCAF、P300)、去乙酰化酶(HDAC4、HDAC1)的mRNA表达;采用免疫组织化学检测APC、PTEN、β-catenin的蛋白表达水平;同时应用亚硫酸氢盐基因组测序法(bisulfite genomic sequencing)检测息肉组织及正常大肠黏膜APC基因启动子甲基化状态。 结果： 多发息肉与单发息肉β-catenin mRNA表达增加,差异有统计学意义,而PTEN和APC mRNA表达下降,差异无统计学意义。多发息肉与单发息肉蒂部黏膜β-catenin mRNA表达增加,差异有统计学意义;PTEN mRNA表达下降,但差异无统计学意义,而APC的变化不明显。多发息肉和单发息肉APC和PTEN的蛋白表达下降,差异有统计学意义,β-catenin的蛋白表达增加,但差异无统计学意义。无论在息肉、息肉蒂部黏膜还是正常大肠黏膜组织,β-catenin全部为膜线性表达。测序发现APC基因扩增病例中除个别息肉蒂部黏膜样本APC CpG岛甲基化率为10%,其余息肉、息肉蒂部黏膜及正常大肠黏膜APC基因扩增产物所有CpG都变成了TpG,提示未发生甲基化。多发息肉和单发息肉乙酰转移酶CBP下降,差异有统计学意义,去乙酰化酶HDACl增加(P=0.051),其余乙酰化酶的差异无统计学意义。多发息肉和单发息肉蒂部黏膜乙酰转移酶CBP下降,差异有统计学意义,其余乙酰化酶的差异无统计学意义。 结论： 儿童大肠息肉,无论是单、多发息肉还是其蒂部黏膜,在基因转录水平β-catenin的表达明显增加,而在蛋白质水平APC和PTEN的表达明显下降,同时乙酰化的程度减弱,而APC基因的甲基化事件发生频率较低。表明抑癌基因的表达下降和癌基因的表达增加可能参与了儿童大肠息肉的形成,乙酰化程度下降可能是其表观遗传特点。