PGI通过HIF-1α影响乳腺癌MCF-7细胞增殖凋亡的机制研究

作     者：王芬 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李静

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：乳腺癌 MCF-7细胞 PGI HIF-1α 

摘      要：背景目的近年来,我国乳腺癌的发病率和死亡率均呈持续上升趋势,其中雌激素依赖型乳腺癌发病率约占50%0%。内分泌治疗对雌激素依赖型乳腺癌具有良好疗效,但其治疗后期转移率高,导致治疗效果不佳。作为肿瘤细胞有氧糖酵解途径的关键酶,磷酸葡萄糖异构酶（phosphoglucose isomerase,PGI）在糖酵解代谢过程中调控葡萄糖-6-磷酸酶与果糖-6-磷酸酶之间的互相转化。PGI分泌到细胞外后被称为自分泌因子（autocrine motility factors,AMF）,AMF与自分泌因子受体相结合,促进肿瘤的增殖、浸润和转移。在乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中均可见PGI的异常表达,而PGI的异常表达可能还与肿瘤恶性程度密切相关。缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）是低氧条件下肿瘤细胞的中心调节因子,参与了肿瘤血管形成、细胞增殖和细胞粘附等一系列过程。HIF-1包括HIF-1α和HIF-1β,HIF-1α主要调控肿瘤的生长和转移,此外,还可以调控HKII、PGI、PKM2和LDHA等基因的转录和表达。新近研究表明:糖酵解关键酶中的PKM2可反向调控HIF-1α的表达。PGI是否也有类似的作用?PGI与HIF-1α二者相关性如何?PGI是怎样进行调控的?目前尚未见报道。因此,本研究对乳腺癌中的PGI和HIF-1α进行检测,探究两者在乳腺癌中的表达情况,通过RNAi技术干扰PGI的表达,进而检测干扰PGI对HIF-1α的表达以及对MCF-7细胞增殖、凋亡和糖酵解的影响,并对其相关调控机制进行初步探究。方法第一部分收集30例乳腺癌患者的癌组织及其相应癌旁组织,通过PCR、免疫组化检测癌组织与癌旁组织中PGI及HIF-1α的表达;用PCR和Western blot检测乳腺癌细胞MCF-7及正常乳腺细胞MCF-10A中PGI以及HIF-1α的表达。第二部分采用慢病毒质粒进行感染,构建干扰PGI的MCF-7细胞并筛选稳转株,采用免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测感染效果,并采用Western blot技术检测干扰PGI对MCF-7细胞中HIF-1α蛋白表达的影响。光学显微镜下观察干扰PGI对细胞生长的影响;CCK-8法检测干扰PGI对细胞增殖的抑制作用;Hochest染色以及FCM检测干扰PGI对细胞凋亡的影响;同时通过FCM检测干扰PGI对MCF-7细胞周期的影响;随后,采用Western blot检测干扰PGI对细胞周期以及凋亡通路蛋白的影响。通过乳酸含量检测法检测干扰PGI对MCF-7细胞乳酸产量的影响,并采用Western blot检测干扰PGI对肿瘤糖酵解相关酶表达的影响。结果1.乳腺癌组织中的PGI和HIF-1α均明显高于癌旁组织。2.乳腺癌细胞MCF-7中PGI和HIF-1α的含量高于正常乳腺细胞MCF-10A。3.乳腺癌细胞MCF-7中干扰PGI后HIF-1α的表达量随之减少。4.干扰PGI明显抑制MCF-7细胞的增殖能力。5.干扰PGI可将MCF-7细胞的周期阻滞在G0/G1期,各组G0/G1期所占比例如下:Control组（43.98±0.45）%、Mock组的（45.57±1.16）%、PGI-si RNA组（66.12±1.12）%,差异均具有统计学意义（P0.01）。***检测结果显示:Control组、Mock组和PGI-si RNA组凋亡率分别为（3.45±0.12）%、（4.35±0.08）%和（11.89±0.65）%,PGI-si RNA组细胞凋亡率高于Control组和Mock组（P0.01）。*** 33258染色结果显示:Control组和Mock组细胞呈均匀的蓝色荧光;PGI-si RNA组细胞可见不同程度的染色质凝集、核浓缩且发出较强的蓝白色荧光等典型的凋亡形态学改变。8.乳酸含量检测结果显示:Control组、Mock组和PGI-si RNA组乳酸浓度分别为（3.801±0.346）mmol/L、（3.863±0.194）mmol/L和（1.133±0.194）mmol/L,PGI-si RNA组乳酸浓度低于Control组和Mock组（P0.01）。结果提示:干扰PGI可使MCF-7细胞的乳酸总产量降低。*** blot检测:干扰PGI后凋亡相关蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表达增加,抑凋亡蛋白Bcl-2表达减少;细胞周期相关蛋白Cyclin D1和CDK4及糖酵解相关酶HKII、PKM2和LDHA的表达均减少;PI3K、AKT和m TOR蛋白的表达亦减少。结论1.乳腺癌中HIF-1α与PGI均异常增高。2.干扰PGI后HIF-1α的表达量减少,同时可以抑制MCF-7细胞的糖酵解和细胞