脂质体介导的pIRES2-EGFP-NT-3转染骨髓基质细胞的实验研究

作     者：寿奋勇 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李雷

授予年度：2010年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：BMSCs NT-3 真核共表达载体 基因转染 神经营养因子 

摘      要：目的 本实验拟观察阳离子脂质体介导的含人神经营养素-3(NT-3)和绿色荧光蛋白(EGFP)基因共表达真核载体转染骨髓基质细胞(BMSCs)后的表达及其是否促进BMSCs向神经元样细胞方向分化。 材料与方法 1、骨髓基质细胞(BMSCs)的分离及培养 选用体重100-150g的雄性Wistar大鼠,麻醉后在无菌条件下取得双侧股骨,取其骨髓用全骨髓贴壁法进行细胞培养,通过传代使BMSCs不断纯化,计数后备用。 2、BMSCs的鉴定 通过用流式细胞仪方法检测大鼠BMSCs的CD34及CD90的表达情况,并诱导BMSCs向脂肪细胞及成骨细胞方向分化的方法进行综合鉴定。 3、阳离子脂质体介导的NT-3基因转染BMSCs 选取第3代BMSCs,接种于6孔培养板中,用脂质体介导的方法进行转染,分别设未转染组(A组)、空载体转染组(B组)和转染组(C组)。48h后检测瞬时表达。 4、检测指标 (1)倒置荧光显微镜下观察各组细胞GFP的表达情况并记录。 (2)利用反转录-PCR (RT-PCR)方法检测各组细胞转染48h时NT-3、NSE mRNA的表达情况。 (3)利用Western-blot方法检测各组细胞转染48h时NT-3蛋白的表达情况。 结果 1、大鼠BMSCs的形态学观察及鉴定 原代细胞接种后3天镜下可见大量悬浮的死亡细胞,圆形,多为血细胞,换液后可见呈集落样生长的贴壁细胞群,分布不均匀,呈梭形、三角形,约8-10天细胞达到90%以上融合。随着传代BMSCs纯度越来越高,大量长梭形的细胞均匀贴壁生长,成簇排列,传代24h即进入对数生长期,约传到P3代时细胞均匀的呈漩涡状排列生长,呈长梭形,形态基本均一。 流式细胞仪检测大鼠BMSCs的CD34呈阴性表达(表达率0.43%);CD90呈阳性表达(表达率96.77%),BMSCs成骨诱导后,碱性磷酸酶呈强阳性。BMSCs成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中大小不等的红色脂滴。 2、GFP的表达 各组细胞在倒置荧光显微镜下观察,除A组(未转染组)外,B组和C组均可见到发绿色荧光的细胞, 3、RT-PCR结果 C组NT-3的mRNA表达明显高于A组和B组,A、B两组几乎未见NT-3mRNA的表达,C组NSE的mRNA表达明显高于A组, 4、Western-blot结果 C组NT-3蛋白的表达明显高于A组和B组,A、B两组表达较弱 结论 1、通过全骨髓贴壁培养法成功分离培养BMSCs,利用其贴壁特性,经过传代可以使其不断纯化而达到实验要求。 2、脂质体Lipofectamin2000可以顺利将真核共表达质粒pIRES2-EGFP-NT-3转染大鼠BMSCs。 3、转染后的BMSCs细胞生长状态良好,目的基因NT-3表达良好,示踪基因GFP表达良好。 4、NT-3转入大鼠BMSCs后可以促进其向神经元样细胞方向分化。