中国南海细菌Pseudoalteromonas ***4-3所产丝氨酸蛋白酶研究

作     者：侯晓彦 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张玉忠;陈秀兰

授予年度：2010年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：丝氨酸蛋白酶 基因克隆 重组表达 溶藻活性 Pseudoalteromonas sp. CF4-3 

摘      要：海洋中存在着种类繁多的微生物类群,是获取新药和新酶的宝贵资源,具有很好的开发前景。本文以中国南海沉积物中分离到的菌株Pseudoalteromonas sp. CF4-3为研究对象,经过阴离子交换层析后,从其发酵粗酶液中分离到了个电泳纯的蛋白酶,命名为CF43。N-端测序结果显示该酶与Pseudoalteromonassp.A28分泌的一种具有溶藻活性的胞外丝氨酸蛋白酶N端10个氨基酸序列有90%的同源性。通过PCR与TAIL PCR技术从Pseudoalteromonas sp. CF4-3基因组中扩增得到了CF43的基因CF43。序列分析表明,基因CF43全长2145 bp,编码一个含714个氨基酸残基的S8家族的丝氨酸蛋白酶,该酶前体由前导肽、N-端信号肽、催化结构域和两个PPC结构域组成。CF43与菌株Pseudoalteromonas sp. A28分泌的丝氨酸蛋白酶氨基酸序列具有86%的相似性。 利用表达载体pET-22b(+)将基因CF43在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达,通过阴离子柱交换层析得到了重组丝氨酸蛋白酶CF43的成熟酶。通过N-端测序确定了成熟酶的起始氨基酸位点为,质谱测定CF43分子量为35 kDa,因此确定成熟酶由327个氨基酸组成。该酶最适酶活温度为50。C,最适酶活pH为8.5,热稳定性较好,50℃时半衰期(t1／2)为60 min。该酶最适合的底物为FAAF,对底物AAPF, AAPL, AAPK, AAPR的活性依次减弱,而对AAK, AAV, GGF基本不能降解。酶学动力学研究表明CF43在50℃时水解FAAF的Km值为3.17mM。金属离子对酶活影响实验表明,对CF43酶活具有促进作用的有Mn2+和Sn2+;而K+、Mg2+、Ba2+、Cu2+、和Ca2+对CF43酶活没有明显影响;Zn2+、Ni+、Co2+、Sr2+、Fe2+对CF43酶活则有明显的抑制作用。此外还测定了该酶的溶藻作用。用CF43处理螺旋藻,发现它能使螺旋藻断裂成小片段和单细胞,但不裂解螺旋藻细胞。用CF43处理水华鱼腥藻,可以导致鱼腥藻断裂和营养细胞破裂。这种特异的溶藻性质表明CF43可能在处理水华、赤潮等水污染中具有较好的应用潜力。