白藜芦醇合成代谢关键酶基因4CL和RS融合表达研究

作     者：张二浩 

作者单位：中国林业科学研究院 

学位级别：硕士

导师姓名：郭雪峰

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：白藜芦醇 对香豆酰辅酶A连接酶 白藜芦醇合酶 融合基因 大肠杆菌 

摘      要：白藜芦醇是高等植物受到真菌感染、机械损伤及紫外线辐射时产生的一种植保素,是一种非常重要的次级代谢产物。作为红葡萄酒的有效成分,它可预防多种疾病,如抗凝血、抗氧化、抗炎免疫、抗癌、心血管保护和神经保护等作用。然而,一般植物中白藜芦醇的含量都比较低,难以满足市场的需求。生物合成白藜芦醇是目前的研究热点。本研究克隆了拟南芥对香豆酰辅酶A连接酶(4CL)基因与花生白藜芦醇合酶(RS)基因,进一步采用基因融合技术将4CL基因与RS基因置于同一表达框中,可以诱导表达出融合的双功能酶,最后添加底物对香豆酸来检测构建的双功能酶的活性,从而实现白藜芦醇的微生物合成。主要研究结果:1.拟南芥4CL基因的研究:设计特异性引物4CL-F1和4CL-R1从拟南芥的嫩叶中克隆出4CL基因,并对克隆的4CL基因序列进行测序分析,克隆得到的4CL基因编码区全长为1686 bp,编码561个氨基酸。通过Bam HⅠ和HindⅢ两个酶切位点成功地构建表达载体p ET-30a/4CL并转化宿主菌株Escherichia coil BL21(DE3),随后利用菌液PCR、酶切反应及测序对所构建的p ET-30a/4CL进行阳性鉴定。通过添加外源诱导剂IPTG(0.3m M),得到诱导表达的蛋白约为66 k Da,进一步分析表明28℃诱导温度下得到的目的蛋白是可溶性的,这为后面的发酵试验选择较低的诱导温度提供了依据。2.花生RS基因的研究:设计特异性引物RS-F1和RS-R1从花生鲁花14的嫩叶中克隆出RS基因,通过测序分析克隆的RS基因编码区全长为1170 bp,可以编码389个氨基酸。通过Bam HⅠ和SalⅠ酶切位点成功地构建表达载体p ET-30a/RS并转化宿主菌株*** BL21(DE3),随后进行了阳性鉴定。进一步分析,添加外源诱导剂IPTG(0.3 m M),28℃诱导温度下进行诱导表达,得到的目的蛋白分子量约为43 k Da,而且为可溶性蛋白。3.融合基因4CL::RS的研究:设计一条15个氨基酸长度的柔性linker,编码的氨基酸序列为(GGGGS)3,并将其对应的核苷酸序列设计为ggt gga ggc gga tcc ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg(划线序列为Bam HⅠ酶切位点)。根据克隆得到的4CL基因与RS基因的序列,设计五个特异性引物,即4CL::RS-F1、4CL::RS-R1、4CL::RS-F21、4CL::RS-F22及4CL::RS-R2。通过多步PCR反应、Bam HⅠ单酶切反应以及连接反应,最终构建出融合基因4CL::RS。通过NcoⅠ与Eco RⅠ酶切位点成功地构建重组载体p ET-30a/4CL::RS并转化宿主菌株*** BL21(DE3),随后进行了阳性鉴定。28℃诱导表达8 h后,分别通过Protein IsoTM Ni-NTA Resin纯化及Western blot分析,结果进一步验证构建的原核表达载体p ET-30a/4CL::RS能够表达出目的融合蛋白。4.白藜芦醇的生物合成研究:为了检测重组菌合成白藜芦醇的能力,建立了白藜芦醇的高效液相色谱检测方法。在本实验条件下(培养基为LB培养基,发酵温度28℃,发酵时间48 h,对香豆酸浓度为1 m M),重组菌发酵得到的白藜芦醇产量为80.524 mg/L,对应白藜芦醇的摩尔转化率为35.28%。结果进一步证实构建的重组菌诱导表达的融合蛋白具有对香豆酸辅酶A和白藜芦醇合酶的双重活性。本研究首次采用酶切位点相连法将拟南芥4CL基因和花生RS基因融合起来,通过体外酶促反应证明了诱导表达的融合蛋白具有双功能酶活性,最终在大肠杆菌中建立了白藜芦醇的生物合成途径。