肺结核患者外周血单个核细胞蛋白质差异表达研究

作     者：陈小波 

作者单位：广州医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：李时悦

授予年度：2009年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：肺结核 双向凝胶电泳 外周血单个核细胞 Coronin-1A Pleckstrin 

摘      要：研究背景与目的: 结核病(tuberculosis,TB)是一种由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病,可侵及全身各系统、各脏器,其中以肺结核(pulmonary tuberculosis,PTB)最为常见。随着HIV感染的流行、耐药菌株的不断出现以及移民和贫困等客观因素,结核病在全球范围内出现了大回升,是严重危害人类健康的主要传染病,是全球关注的公共卫生和社会问题。 在机体介导的细胞免疫反应中单核巨噬细胞是结核杆菌的主要栖居地,也是宿主抗原提呈和抗菌的主要效应细胞,而淋巴细胞是主要的免疫调控细胞。因此,从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)研究结核病发病的机体的免疫机制具有重要的意义。 随着蛋白质组学(Proteomics)理论和技术的发展和完善,使人们从组织或细胞的蛋白质整体表达水平研究疾病成为可能。以疾病病变组织或细胞为实验材料进行蛋白质组学的研究,能真实的反映机体疾病情况,可以为疾病的早期诊断提供新的特异性的分子标记物,又可以同时检测、跟踪疾病的发展和预后情况,并为认识疾病的发病机制提供新的线索。因此,疾病蛋白质组学的研究有着重要的临床意义和应用前景。本实验首次应用蛋白质组学技术包括双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)和质谱(mass spectrometry,MS)技术来分析和鉴定肺结核病患者和健康志愿者PBMC差异表达的蛋白质,为阐明结核病发病的免疫学分子机制提供新的线索,找出可能的诊断标志物和有效治疗靶点。 方法: 1.样本收集处理:收集PTB患者和健康志愿者各10例,抽取外周静脉血并用肝素抗凝,人淋巴细胞分离液(相对密度1.077)密度梯度离心分离出PBMC。提取PBMC总蛋白质,用Bradford法进行蛋白浓度测定。 2.蛋白分离:利用2-DE对PTB患者和健康志愿者PBMC的总蛋白进行分离,然后进行考马斯亮蓝染色,扫描图像并获取蛋白质双向凝胶电泳图谱。应用ImageMaster 2D Elite 6.0分析软件对向电泳凝胶图谱进行分析,寻找两组间差异表达的蛋白质点。通过胶内酶切,点样,应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)获得蛋白质的肽质量指纹图谱(Peptide mass fingerprint,PMF),最后利用Mascot软件搜索NCBInr蛋白质数据库鉴定明确是何种蛋白质。 3.选取可能与PTB发病机制相关的差异表达蛋白质,应用Western blot方法对差异蛋白质的表达量进行验证。 结果: 1. PTB组和正常对照组各2块凝胶间匹配点数为1103±25和1053±42,其平均匹配百分率分别为87.9%和86.3%;同一样本2块不同凝胶之间在等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)方向的平均偏差为(1.17±0.18)mm,在十二烷基磺酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳(Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)方向上的平均偏差为(1.09±0.14)mm。从而建立了重复性较好的PTB患者及健康人群PBMC的双向电泳图谱(17cm PH3-10NL IPG胶条)。 2.对10例PTB患者和健康志愿者PBMC的双向电泳图谱进行匹配分析,其平均匹配点数为886±17个。找出14个差异表达的蛋白质点,其中11个蛋白质点在PTB组中表达上调,3个蛋白质点表达下调。对14个差异表达的蛋白质点进行MALDI-TOF-MS鉴定获得14张蛋白质点的肽质量指纹图谱(PMF),共鉴定出12种差异蛋白质,通过文献检索,发现其中有2种蛋白质可能与PTB发病相关的,分别为Coronin-1A和Pleckstrin。 3.用Western blot方法在蛋白水平对Coronin-1A和Pleckstrin的表达情况进行验证。结果显示Pleckstrin在PTB组中表达下调,与双向电泳的分析结果一致,Coronin-1A并没有显示表达量的明显差异。 结论: 本研究采用比较蛋白质组学的方法对PTB患者和健康志愿者PBMC进行研究,建立了重复性良好的PTB患者和健康志愿者PBMC的双向凝胶电泳图谱,比较分析两者蛋白质表达的差异,鉴定出14种的差异蛋白质。参考国内外研究结果发现其中的Coronin-1A和Pleckstrin可能通过对单核吞噬细胞吞噬作用的调节在PTB发病中起着重要作用;Western blot证实Pleckstrin在PTB组中表达下