小鼠脊髓神经干细胞分离培养、分化及其影响因素研究

作     者：袁婧 

作者单位：昆明医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：申丽娟;王淑芬

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：脊髓神经干细胞 Y-27632 增殖 分化 GFAP 成体 Nestin 脊髓节段 

摘      要：[目的]神经退行性疾病是由神经元或其髓鞘的丧失所致的疾病,随着时间的推移而加重,最终导致功能障碍。因其发病机理复杂,其病理机制至今尚未阐明,临床治疗尚无肯定而有效的措施。神经干／祖细胞治疗为这类疾病治疗带来了希望,但在干细胞临床应用之前,需要我们清楚干细胞增殖和分化的调控机制及干细胞定向分化策略,从而使之向指定的方向分化。调控干细胞增殖信号通路中,Rho/Rho(Ras homologue)激酶信号传导通路是焦点之一。本实验选择Rho激酶抑制剂Y-27632将其运用于小鼠脊髓神经干细胞的培养和分化之中,研究Rho激酶抑制剂Y-27632对于小鼠脊髓源性神经干细胞增殖及分化的影响。[方法]选择13-15天的C57胚胎期小鼠,分离获得脊髓组织,使用胰酶消化并悬浮培养后获得神经干细胞,用免疫荧光染色法鉴定带有神经干细胞特异标记物Nestin和Sox2的细胞,将所获得的神经干细胞分为实验组与对照组,在实验组中加入Y-27632 (10μoml/L),研究Y-27632对神经千细胞增殖、分化的作用。在神经干细胞培养体系中,持续5-7代加入Y-27632,通过免疫荧光染色法、定量RT-PCR及Western-Blot蛋白水平检测法等,检测神经干细胞干性标记、分化细胞标记以及BrdU与Nestin双阳性的细胞。在神经干细胞含0.5%FBS的分化培养体系中加入Y-27632,用免疫荧光染色法、western blo、 RT-PCR检测神经干细胞及其各分化细胞的情况,分析Y-27632对神经干细胞分化的影响。[结果]从13-15天胚胎期小鼠脊髓中分离培养获得神经干细胞,神经干细胞特异性标记Nestin(巢蛋白)阳性细胞纯度高于90%。通过免疫荧光染色法、Western Blot和RT-PCR等方法,从细胞数量、蛋白表达水平和RNA水平比较发现：对悬浮培养的神经干细胞,Y-27632抑制其增殖能力而促进其分化。为进一步验证Y-27632促进分化的作用,在神经干细胞自发分化体系中加入Y-27632。Y-27632促进神经干细胞分化为GFAP阳性细胞。[结论]Y-27632 (10μoml/L)对小鼠脊髓神经干细胞的增殖无促进作用;Y-27632有促进小鼠脊髓神经干细胞向星形胶质细胞分化的作用。[目的]长期以来人们认为哺乳动物成体神经细胞及神经通路出生后就固定不变的,中枢神经系统脑及脊髓受损将导致永久性的功能损失。然而,1992年Reynolds成功从成年小鼠纹状体中培养出神经干细胞及1996年脊髓神经干细胞的成功培养,说明出生以后神经再生还持续存在,干细胞治疗为神经退行性疾病治愈提供了可能。人们对神经干细胞的研究经历了从胚胎干细胞、胚胎时期培养获得的神经干细胞到从成体动物神经组织内直接获得神经干细胞的研究过程。对前二者的研究,由于不可避免的移植排斥反应,应用时需大剂量的免疫抑制剂。而从成体动物体内获得神经干细胞则没有此方面的问题。但脊髓神经干细胞的培养较脑源性神经干细胞培养困难。成体脊髓长度较长,含有大量的神经纤维及髓鞘,本实验将研究成体脊髓各节段的神经干细胞情况,系统比较各节段神经干细胞的差异,寻找能更有效的培养出神经干细胞的方法。[方法]选择8-12周的C57成年小鼠,分离获得脊髓组织,按照颈、胸、腰、骶尾分为四段,经酶消化并培养后获得神经干细胞,用免疫荧光染色法鉴定带有神经干细胞特异标记物Nestin和Sox2的细胞,并进行计数比较;分别进行传代后,比较倍增数。各节段的神经干细胞予以含0.5%FBS的分化培养基自然分化7天后,用免疫荧光染色法观察形态。将小鼠的脊髓组织各节段分别进行提取蛋白及RNA,通过Western Blot、 RT-PCR检测比较其神经干细胞含量。对脊髓各节段经冰冻切片后,行免疫荧光染色后,比较神经干细胞的数量情况。[结果]从8-12周的C57成年小鼠中,分离脊髓组织经酶消化培养,成功获得神经干细胞,经免疫荧光染色法鉴定带有神经干细胞特异标记物Nestin和Sox2的细胞,计数后比较培养的神经干细胞数量：胸段颈段腰段骶尾段。从细胞传代倍增数上比较：胸段颈段腰段骶尾段。对脊髓组织不同节段在蛋白及RNA水平比较神经干细胞含量：颈段胸段腰段骶尾段。脊髓组织进行切片染色后细胞计数神经干细胞含量：颈段胸段腰段骶尾段。[结论]成年C57小鼠脊髓各节段干细胞含量：颈段胸段腰段骶尾段。从细胞培养的有效性上,骶尾段含有的神经纤维及髓鞘较颈、胸、腰段的少,神经干细胞含量最多,体外培养的神经干细胞也最多。