氢盐水对兔脊髓缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

作     者：孙延卿 

作者单位：第二军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈雄生

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：氢盐水 脊髓损伤 缺血再灌注 凋亡 抗氧化 

摘      要：一、研究目的 脊髓损伤常导致患者肢体残疾和心灵创伤。而且，脊髓损伤越来越多的出现于年轻人当中，给社会和家庭带来了巨大的负担。由于目前对于脊髓损伤的药物治疗有限，而且作用不甚明显，因此，一直以来对脊髓损伤的治疗都是临床和基础研究的重点。脊髓损伤过程分为原发损伤和继发损伤，缺血再灌注损伤(spinal cord ischemicreperfusion injury，SCII）是造成脊髓继发损伤的主要病理基础。在此过程中，自由基对脊髓的继发性损伤起了重要作用。研究显示，氢能选择性清除体内羟自由基和过氧亚硝酸阴离子，对缺血/缺氧损伤产生治疗作用。本研究拟建立脊髓缺血再灌注损伤的动物模型，选用氢盐水对兔进行腹腔注射治疗，通过检测清除自由基、抑制神经细胞凋亡和减轻炎症反应等方面相关指标，探讨氢盐水对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用机制。本研究为氢治疗脊髓缺血再灌注损伤提供实验证据，也为氢今后用于脊髓损伤的药物治疗提供理论依据。 二、研究方法 （一）制备兔脊髓缺血再灌注损伤模型 采用ZIVIN法，即直接于左肾动脉分支处远端0.5cm处及左右髂动脉分支上端，以动脉夹完全钳夹腹主动脉造成脊髓腰骶段缺血，夹闭35min后松开动脉夹，以建立脊髓缺血再灌注损伤模型。 （二）实验动物及分组 新西兰大白兔30只，分为3组：A组（假手术组10只）：只开腹而不夹闭腹主动脉;B组（对照组10只）：开腹并夹闭腹主动脉35min，于再灌注前5min腹腔注射生理盐水;C组（氢盐水治疗组10只）：开腹并夹闭腹主动脉35min，于再灌注前5min腹腔注射饱和氢盐水。 （三）兔后肢运动功能评价 分别于术后6h、12h、24h、72h用单盲法观察兔后肢运动功能，并参照Tarlov5分制标准进行评分。 （四）组织病理学观察 于术后72h处死各组动物，取脊髓组织用10%福尔马林中性溶液固定、脱水、切片，分别行HE染色和TUNNEL染色检测，观察脊髓神经细胞形态学变化和凋亡情况。 （五）丙二醛（MDA）含量和过氧化氢酶（catalase,CAT)活性检测 丙二醛是细胞凋亡时细胞膜发生脂质过氧化反应的产物，过氧化氢酶活性是组织抗氧化能力的主要指标之一。方法：处死动物时取脊髓组织匀浆、离心后取上清液分别用脂质氧化(MDA)检测试剂盒(lipid peroxidation MDA assay kit)和过氧化氢酶检测试剂盒(catalase assay kit)检测脊髓组织中相应指标。 三、结果 （一）后肢神经功能评分结果 于再灌注6h、12h、24h、72h观察各组动物后肢运动功能。A组术后Tarlov评分无下降。B组和C组兔脊髓缺血再灌注损伤后Tarlov评分出现下降。C组兔脊髓缺血再灌注损伤后Tarlov评分显著高于B组（P0.01）。 （二）脊髓组织病理学结果 1、HE染色 光镜下观察A组兔脊髓组织灰白质界限清楚，神经细胞形态完整。B组兔脊髓组织灰白质界限欠清楚，大量神经细胞坏死，胞浆内颗粒变性和空泡变性。C组神经细胞结构基本完整，核仁明显，见少量神经元细胞空泡变性。 2、TUNNEL染色 光镜下观察A组兔脊髓组织见未见神经细胞凋亡;B组见脊髓组织破坏严重，大量凋亡的神经细胞，核固缩，核浓染，大量炎性细胞浸润;C组见脊髓组织少量凋亡细胞及少量炎性细胞浸润。 3、丙二醛(MDA)含量和过氧化氢酶（CAT）活性的检测 B组和C组脊髓组织中MDA含量增加，C组MDA含量明显低于B组（P0.05），差异有统计学意义。B组和C组CAT活性均低于A组，C组CAT活性明显高于B组（P0.05），差异有统计学意义。 四、结论 氢盐水能抑制MDA的产生和提高CAT活性，具有明显的抗氧化作用和抑制脊髓神经细胞凋亡，对家兔脊髓缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。