番茄细菌性溃疡病菌的LAMP检测及其拮抗生防菌的筛选

作     者：毛芙蓉 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张世宏

授予年度：2016年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：番茄细菌性溃疡病 PCR LAMP 生防菌 

摘      要：番茄细菌性溃疡病(Bacterial canker of tomato)是目前番茄生产上一种潜在的重大病害,由密执安棒状杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis ***,以下简称为Cmm)引起。该病害于1909年首次在美国密执安州的温室番茄上被发现,现已广泛分布于世界60多个国家和地区的番茄生产区。番茄细菌性溃疡病于1954在我国年首次被报道,目前在北京、吉林、辽宁、黑龙江、新疆、内蒙古、甘肃、宁夏、四川、山东、山西、河北、河南、海南和上海等地均有发生,产量损失一般在25%5%,而且发生面积和危害程度呈逐年上升趋势,严重制约了我国番茄制种业和加工业的发展。Cmm主要通过种子或种苗带菌传播,通过雨水飞溅和农事操作扩散。在番茄的各个生育期均可发病,一旦发病迅速蔓延,危害严重,且防治困难。为控制Cmm在世界范围内的扩散、传播,许多国家将其列为检疫性有害生物。因此建立简单、灵敏、快速的检测方法和开发有效的防治方法对控制该病害的发生、蔓延具有十分重要的生产意义。本研究建立了以Cmm的三个特异性基因mic A,cyt C和tom A为检测目标的PCR、LAMP检测方法,并从番茄根际土壤中筛选出对Cmm具有明显拮抗菌效果的生防菌。主要研究结果如下:1、以Cmm的3个特异性基因mic A,cyt C和tom A为检测靶标,通过引物的设计与优化、特异性测试、灵敏度测试等,建立了番茄细菌性溃疡病菌的定性PCR检测方法。实验结果表明:针对tom A基因的检测灵敏度最高,对Cmm基因组的最低检测浓度为5copy/μL,对菌悬液的最低检测浓度为103cfu/m L。2、以Cmm的2个特异性基因cyt C和tom A为检测靶标,分别各设计了两组LAMP引物cyt C-49、cyt C-170;tom A-107、tom A-8和相应的环引物。通过引物特异性和灵敏性测试,结果表明:引物tom A-107的灵敏性最好,对Cmm菌的检测灵敏度达5×102copy/μL。本研究建立的以tom A基因为靶标的Cmm LAMP检测方法,能在50 min内完成整个检测过程,并且结果可视,非常适用于Cmm菌株的现场快速检测。3、从采集到的14份番茄根际土壤中成功分离出260株不同的生防菌,采用平板对峙法进行拮抗筛选,最终筛选出35株对Cmm表现出良好拮抗性的生防菌。通过形态学和分子生物学的方法将这35株菌分成三大类,分别为芽孢杆菌属,假单胞菌属和链霉菌属。