GT1-7细胞中重要功能基因KISS1和GnRH启动子DNA甲基化的研究

作     者：贾梅兰 

作者单位：东华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周宇荀

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：GT1-7细胞 KISS1基因 GnRH基因 DNA甲基化 二代测序 

摘      要：背景:DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式,是基因组DNA在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使Cp G二核苷酸5 端的胞嘧啶转变为5 甲基胞嘧啶的反应。DNA的甲基化在胚胎发育、维持正常细胞功能以及人类肿瘤发生中起着重要作用,是目前最新的研究热点之一。基因启动子区域Cp G岛胞嘧啶甲基化是抑制基因表达的重要途径。传统DNA甲基化研究方法中的亚硫酸氢盐修饰后的克隆测序的方法操作繁琐,价格昂贵。二代测序(The next generation sequencing,NGS)技术的出现,极大得促进了表观遗传学的研究。目的:GT1-7细胞是研究性发育的理想模型细胞,KISS1基因和Gn RH基因是性发育中两个最重要的功能基因。查阅相关文献表明该细胞中KISS1基因和Gn RH基因的启动子甲基化的研究尚未见报道。本实验使用亚硫酸氢盐对GT1-7细胞和L929细胞基因组DNA修饰后的PCR产物进行二代测序。同时利用金标准的亚硫酸氢盐修饰后克隆测序的方法作为对照,对相同批次的GT1-7细胞的PCR产物进行测序。对GT1-7细胞中KISS1基因和Gn RH基因启动子范围内Cp G位点甲基化状态进行了研究。探索利用二代测序对候选基因甲基化水平进行检测的技术。方法:利用RT-PCR和生物信息学在线软件(PROMOTER2.0、Neural Network Promoter Prediction)确定KISS1基因转录本的类型,以及该转录本的启动子序列;利用JASPAR对启动子序列进行转录因子结合位点分析;利用试剂盒提取GT1-7细胞和L929细胞基因组DNA并进行亚硫酸氢盐处理;利用Methyl-primer软件设计亚硫酸氢盐处理后测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)引物,进行巢式PCR;将巢式PCR产物进行文库构建,上机二代测序。同时将相同批次纯化的GT1-7细胞的PCR产物与p GM-T Fast载体连接及转化,对克隆产物进行菌落PCR的鉴定,对阳性克隆菌液进行一代测序。结果:RT-PCR检测,确定了GT1-7细胞中KISS1基因的转录本的类型是KISS1-002,本研究中以KISS1-002转录本为研究对象。PCR产物建库二代测序结果表明,GT1-7细胞KISS1和Gn RH两个基因启动子区域中27个Cp G位点甲基化位点信息完整,KISS1基因启动子区域内(Cp G1-Cp G20)的平均甲基化水平为78.74%(Cp G位点甲基化水平最高为98.69%,最低为25.37%),Gn RH基因启动子区域内(Cp G1-Cp G7)平均甲基化水平为88.09%(Cp G位点甲基化水平最高为98.52%,最低为55.66%)。挑取10个阳性克隆进行一代测序,序列无丢失,KISS1和Gn RH两个基因27个Cp G甲基化位点信息完整,KISS1基因启动子区域内(Cp G1-Cp G20)的平均甲基化水平为79.00%(最高为100%,最低为20.00%),Gn RH基因启动子区域内(Cp G1-Cp G7)平均甲基化水平为84.28%(最高为100%,最低为60.00%)。L929细胞中二代测序结果表明,GT1-7细胞KISS1和Gn RH两个基因启动子区域中27个Cp G位点甲基化位点信息完整,KISS1基因启动子区域内(Cp G1-Cp G20)的平均甲基化水平为94.07%(Cp G位点甲基化水平最高为86.02%,最低为99.73%)。Gn RH基因启动子区域内(Cp G1-Cp G7)平均甲基化水平为97.32%(Cp G位点甲基化水平最高为98.57%,最低为95.32%)。结论:利用高通量的二代测序技术能够有效的对DNA甲基化的PCR产物进行检测,二代测序和克隆测序都是研究DNA甲基化的有效方法,但前者与克隆测序相比每一个读取序列(reads)都相当于一个单克隆,二代测序使每个区段得到成千上百个reads,因此二代测序结果更加精确。