斜纹夜蛾抗真菌肽基因gallerimycin的克隆及功能研究

作     者：张雯迪 

作者单位：重庆大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王中康

授予年度：2011年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：抗真菌肽 gallerimycin RNAi 斜纹夜蛾 RT-qPCR 

摘      要：Gallerimycin基因是鳞翅目昆虫中的一种抗真菌肽,它可以被多种细菌、真菌甚至金属蛋白酶诱导,在脂肪体中合成,然后分泌到血淋巴中起作用。Gallerimycin主要对丝状真菌有明显活性,对细菌和酵母没有抗性,在昆虫体液免疫中起重要作用。 斜纹夜蛾是一种鳞翅目蔬菜害虫,其幼虫不仅食性杂,而且老熟幼虫会形成暴食,对多种蔬菜都有危害。目前防治斜纹夜蛾幼虫的主要化学方法仍然是使用化学农药。化学农药作为杀虫剂的主要危害是污染环境;容易使害虫产生抗药性;容易残留在蔬菜上危害人类健康。随着人们的环保意识的提高,以及对生活品质要求的提高,化学杀虫剂的危害逐渐显现并引起人们的重视。因此莱氏野村菌等虫生真菌的研究和生防应用得到越来越多的关注。 本研究通过比对GenBank中gallerimycin的蛋白质序列,找出gallerimycin氨基酸的保守序列,设计简并引物,PCR扩增其保守区序列;以gallerimycin基因的保守区序列作为依据,设计特异性引物,采用3’RACE和5’RACE扩增斜纹夜蛾老熟幼虫gallerimycin基因的全长cDNA序列;在获得gallerimycin基因全长cDNA的基础上,通过表达谱分析和RNA干扰研究gallerimycin的基因功能。斜纹夜蛾老熟幼虫gallerimycin基因的功能研究,有助于从分子水平上阐明斜纹夜蛾gallerimycin基因在体液免疫中的分子生物学机制,这对于研发新型生物杀虫剂有重要的指导意义。 1.斜纹夜蛾gallerimycin基因的克隆 以被莱氏野村菌CQNr01侵染的斜纹夜蛾老熟幼虫的cDNA作为模板,根据gallerimycin保守序列设计的简并引物,通过PCR获得一个86bp的基因片段。通过NCBI BLAST进行生物学信息分析,结果表明该片段的基因序列和草地贪夜蛾（Spdoptera frugiperda）有91%的相似性。在斜纹夜蛾gallerimycin基因保守区序列的基础上,设计基因特异性引物,用3’RACE和5’RACE技术扩增得到gallerimycin基因的全长cDNA序列, GenBank登录号为HM747937。克隆得到的斜纹夜蛾gallerimycin基因cDNA序列长380bp,开放阅读框长225bp,共编码75个氨基酸,5’端和3’端非编码区分别长22bp和133bp。该基因编码的蛋白质8.1KDa,等电点8.79,具有一个由20个氨基酸组成的信号肽。进化树分析和氨基酸序列比对表明,该基因编码的产物属于gallerimycin。其一级结构具有gallerimycin的共同特点:具有6个半胱氨酸残基,形成3个二硫键。2.斜纹夜蛾gallerimycin基因的表达谱分析 通过RT-qPCR测定斜纹夜蛾老熟幼虫被莱氏野村菌侵染后的不同时期,gallerimycin基因的表达情况。结果表明,gallerimycin基因的表达是和侵染时间成线性关系的。gallerimycin的表达量随着侵染时间的推移逐步上升,到24小时达到最大值,随后又逐步降低。 ***基因的RNA干扰分析 根据gallerimycin基因的编码区设计干扰引物,通过Ambion公司的MEGAscript? High Yield Transcription Kit试剂盒获得还有T7启动子的gallerimycin dsRNA。用微型注射器将dsRNA注射入斜纹夜蛾老熟幼虫的腹腔。通过real-time PCR分析,干扰效率为73%,通过生物测定,发现gallerimycin基因被干扰的斜纹夜蛾老熟幼虫的抗真菌能力下降。 本研究表明gallerimycin基因和斜纹夜蛾抗真菌能力有直接关系且起到重要作用。