ramR基因突变介导肺炎克雷伯菌替加环素异质性耐药

作     者：张巧禹 

作者单位：福建医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈建森

授予年度：2017年

学科分类：1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：肺炎克雷伯菌 替加环素 异质性耐药 外排泵 RamR 细菌种群分析 实时PCR 

摘      要：目的肺炎克雷伯菌(Kp)是医院感染重要的病原菌,随着广谱抗生素的大量应用,多重耐药或泛耐药的肺炎克雷伯菌逐年增多。替加环素是目前治疗严重感染的最后一线可选择药物。然而,替加环素敏感性下降的Kp亦逐渐增多,对其治疗越感棘手。异质性耐药被认为是细菌从敏感转变为耐药的中间过渡阶段,也是临床抗感染治疗失败的重要原因之一。本文旨在研究Kp对替加环素是否存在异质性耐药,以及发生异质性耐药的分子机制。方法1、收集替加环素敏感的Kp临床分离株,用纸片法筛选,细菌种群分析(PAP)确认替加环素异质性耐药Kp(TGCHR-Kp)。对子代菌株进行连续传代和药敏试验,并应用ERIC-PCR检测TGCHR-Kp亲代和子代菌株之间的同源性。2、应用外排泵抑制剂PAβN与菌株共孵育,琼脂稀释法测定替加环素MIC值。利用实时PCR测定外排泵基因acrA,acrB,tolC及其调控基因ramA的表达水平。3、PCR扩增ramR基因及上下游部分序列并测序。应用BlastN和DNAman软件分析基因突变情况,SWISS-MODEL同源建模方法构建RamR蛋白的四级结构。探讨RamR结构和功能对ramA及其acrA,acrB,tolC基因表达与替加环素MIC值的关系。4、替加环素敏感的Kp标准菌株ATCC13883以及2株临床分离株用替加环素浓度递增的肉汤进行诱导实验,并在含4mg/L替加环素的琼脂平板上筛选耐药菌株。应用PAβN抑制实验结合琼脂稀释法确定诱导前后菌株的MIC值。利用实时PCR测定外排泵基因acrA,acrB,tolC及其调控基因ramA的表达水平。ramR测序并分析基因非同义突变情况。结果1、334株临床分离的Kp菌株共检出22株TGCHR-Kp,阳性率为6.6%。亲代菌株的MIC值在0.5mg/L—1mg/L之间,均为敏感;子代菌株MIC值在26mg/L之间,均为中介或耐药。TGCHR-Kp的耐药频率介于7.14×10-8–1.08×10-5之间。ERIC-PCR检测发现,亲代菌株及其对应的子代菌株所得扩增条带两者一致,高度同源。2、加入PAβN后,22株子代菌株有20株对TGC的MIC下降2倍,但仍有2株保持不变。子代菌株的AcrAB-TolC外排泵基因及其调控基因ramA表达水平均显著高于亲代菌株;acrA、acrB、tolC以及ramA的表达水平均随着MIC值的上升而上升,差异具有统计学意义(P0.01)。3、ramR序列比对分析发现,22株亲代菌株中有11株发生氨基酸残基的点突变,突变位点均集中在α7及其之后的氨基酸序列中,即RamR同二聚体中的二聚体化功能域中。22株子代菌株共有16株发生非同义突变,其中10株发生碱基替换,突变位点主要分布在DNA结合域;6株菌株分别发生碱基的插入或缺失。其余6株子代菌株与其对应的亲代菌株RamR均未发生突变,但子代菌株替加环素MIC值仍较亲代菌株上升26倍。4、替加环素敏感Kp经替加环素逐步诱导后,均可在含4mg/L替加环素的M-H平板上有部分菌落生长。诱导后菌株对替加环素的MIC值上升了4倍,均变为耐药。加入外排泵抑制剂PAβN后,诱导后的菌株替加环素MIC值下降46倍,均由耐药变为敏感。诱导后菌株acrA,acrB,tolC及ramA基因的表达水平均较诱导前显著增高(P0.05)。7株诱导后菌株ramR发生非同义碱基替换、碱基插入或缺失,但仍有1株菌ramR序列并未发生改变。结论首次从替加环素敏感的Kp临床分离株中筛选出TGCHR-Kp。ramR基因发生非同义碱基替换、翻译提前终止、碱基插入或缺失引起RamR蛋白发生结构和功能的改变,从而导致ramA基因和AcrAB-TolC外排泵基因表达水平增高,提示ramR基因突变是介导TGCHR-Kp发生耐药性变迁的重要因素,但并非唯一因素。在Kp耐药变迁过程中,替加环素在诱导ramR基因突变以及耐药形成的过程中均扮演了重要的角色。本研究有助于深刻理解Kp对替加环素的耐药变迁过程,并为指导临床合理使用抗菌药物提供依据。