羟基酪醇对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制研究
作者单位：中国医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：贾大林
授予年度：2018年
主 题：心肌梗死 心肌缺血再灌注损伤 羟基酪醇 线粒体渗透性转换孔道 细胞凋亡
摘 要：目的:急性心肌梗死(AMI)是目前世界范围内致死或致残的主要疾病之一。心肌发生缺血后,对心肌缺血部位及时进行有效的血液再灌注被认为是终止心肌坏死的最佳方法。然而,再灌注本身可能会加剧缺血后的心肌损伤,即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。MIRI的机制还不完全清楚,目前普遍认为与活性氧自由基(ROS)过多、钙超载、pH异常等因素有关。目前,许多研究已经提出了预防和减轻MIRI的方法。其中缺血预适应(IPC)和缺血后适应(IPOC)在诸多动物模型上被证明对MIRI有保护作用,然而在临床上,这两种方法操作复杂,并且有一定的局限性。所以,药物干预防治MIRI具有重要意义。羟基酪醇(Hydroxytyrosol,HT)是地中海饮食初榨橄榄油中的一种酚类化合物,提取自橄榄叶、橄榄油和加工橄榄油产生的废水。HT有多种生物学效应,如调节血脂、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等,尤其是对心血管系统的保护作用最为明显。最近有研究表明,在SD大鼠的在体MIRI模型中,在缺血过程中、再灌注之前5min对其腹腔注射HT可以减轻大鼠MIRI。已有研究报道线粒体渗透性转换孔道(Mitochondria permeability transition pore,MPTP)的过度开放是MIRI的重要机制之一。MIRI发生时,MPTP过度开放,细胞色素C(Cytochrome C)释放入胞浆,激活天冬半胱氨酸特异性蛋白酶(caspase 9和caspase 3),从而导致细胞凋亡。以往研究表明环孢素A(CsA)可通过抑制MPTP开放来减少再灌注引起的心肌坏死和急性冠状动脉相关并发症。细胞内ATP的消耗、ROS过多和Ca超载会引发MPTP过度开放。HT能减少ROS,从而减轻氧化应激相关的损伤。因此我们推测,HT对MPTP开放的作用可能成为研究其减轻MIRI作用的重要切入点。根据以往相关文献报道,本实验开展了以下两个方面的研究:(1)构建大鼠MIRI模型,观察HT对MIRI是否有保护作用;(2)比较MIRI组和HT+MIRI组心肌细胞的MPTP开放情况,以及MPTP下游凋亡通路和MPTP相关调控因子的蛋白表达的变化情况,应用MPTP特异性开放剂苍术苷(Atractyloside,ATR),观察ATR能否取消HT对大鼠MIRI的心肌保护作用,并探讨HT是否通过抑制MPTP开放来发挥对大鼠心脏MIRI的保护作用。研究方法:1、制备大鼠离体心脏MIRI模型(IR组)选取25000克健康的雄性Wistar大鼠心脏,应用Langendorff离体心脏灌流装置行30min全心缺血,120min再灌注制备大鼠离体心脏MIRI模型。2、药物干预缺血前15min将HT经灌流装置给药,给药时间10min,给药速度8ml/min,并再用缓冲液将离体心脏灌流5min以保证将残余HT排净。心脏离体手术前30min给予腹腔注射5mg/kg苍术苷。3、HE染色法观察心肌显微结构变化4、TTC染色法观察心肌梗死面积5、分光光度法检测MPTP开放6、TUNEL染色法观察心肌细胞凋亡情况7、Western blot方法检测Cytochrome C、cleaved caspase 9和cleaved caspase3蛋白表达情况,检测Bcl-2和Bax蛋白表达情况。8、统计学分析:采用SPSS17.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差进行描述。多组间比较采用单因素方差法分析(One Way ANOVA),两组之间比较采用独立样本t检验,两两组间采用LSD检验进行比较;P0.05表示有统计学差异。实验结果:1、三种浓度HT(10μM、100μM、1000μM)给药组中,HE染色法显示各组心肌组织损伤较IR组均减轻,100μM HT组与10μM HT组相比心肌组织损伤程度明显减小,而与1000μM HT组相比无明显差异。TTC染色法测得各组心肌梗死面积较IR组分别减少了4.9%、23.4%和22%;此外,100μM HT组与10μM HT组相比进一步减少心肌梗死面积,但与1000μM HT组相比,没有明显差异。因此我们选择应用浓度为100μM HT进行后续实验并且100μM HT组较IR组心肌显微结构损伤程度更轻,细胞凋亡率显著减少,同时心肌梗死面积显著减少。2、HT治疗可降低Ca诱导的MPTP开放的敏感性,提示HT可抑制MPTP的开放。3、HT给药组较IR组中MPTP下游凋亡相关蛋白Cytochrome C、cleaved caspase 9,cleaved caspase 3的表达量下降,凋亡率降低了16.5%。4、HT给药组较IR组心肌组织中Bcl-2蛋白表达量增加,Bax蛋白表达量降低,Bax/Bcl-2比值降低。5、给予苍术苷干预后,心肌梗死面积较HT治疗组升高,心肌凋亡率升高,提示HT对心肌缺血再灌注损伤的保护作用被苍术苷取消。结论:1、HT能有效减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。2、HT通过过表达Bcl-2蛋白,抑制Bax蛋白的表达,从而抑制MPTP过度开放及其下游凋亡通路的激活,减少心肌缺血再灌注损伤。
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