碱性土壤宏基因组文库的构建以及碱性蛋白酶AP01基因的克隆

作     者：蒋承建 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：武波

授予年度：2005年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：极端微生物 未培养微生物 碱性蛋白酶 宏基因组 ONA文库 阳性克隆 基因 

摘      要：极端微生物是一个巨大的潜在的优势基因资源库,未培养微生物研究是极端微生物研究的一个重要组成部分。未培养微生物在自然界土壤栖息群中占99%以上的资源。直接从碱性土壤中抽提纯化宏基因组DNA构建文库是从分子生物学角度研究微生物基因资源的重要途径,这也是研究未培养微生物的生态、生理等特性的关键方法。 目前从土壤样品中提取纯化总DNA的方法的技术正在不断完善中,而直接提取纯化碱性环境混合基因组DNA的方法很少,而采取直接提取纯化宏基因组DNA构建文库研究碱性环境微生物基因资源特别是未培养微生物基因资源的正式报道暂时没有。 碱性蛋白酶是一类在生理上、商业上非常重要的酶类,现已广泛用于洗涤剂、制革、毛皮以及丝绸工业。此外,它在医药、食品、饲料、环保、化学工程、基础研究中显示了广泛的应用前景。 本研究工作从广西南宁市某纸业公司排污沟中采集碱性土壤样品,直接抽提和分离宏基因组DNA,所获得粗提总DNA的产量为每克土壤样品10～30μg。经过纯化后采用限制性内切酶EcoR1酶部分酶切处理,构建了以pGEM—3Zf(+)为载体的DNA部分文库AL01。AL01文库的包含23,650个克隆,随机插入载体的外源DNA片段平均大小