多环芳烃污染对植物内生细菌分布及相关降解基因多样性的影响

作     者：彭安萍 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：凌婉婷;刘娟

授予年度：2014年

学科分类：083002[工学-环境工程] 0830[工学-环境科学与工程（可授工学、理学、农学学位）] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：多环芳烃 植物内生细菌 群落结构 多样性 降解基因 

摘      要：多环芳烃(PAHs)是一类在环境中广泛存在的持久性有机污染物,其在土壤中易持留、难降解,严重影响农产品安全,可通过食物链危害人群健康和生态安全。能否利用植物内生细菌来调控植物体内PAHs的代谢,进而规避植物有机污染风险、保障农产品安全?这一问题已引起学者广泛关注。了解污染区植物内生细菌的群落结构及其与污染物降解相关基因的多样性,这对于筛选出具有污染物降解功能的内生细菌、更加有效地利用内生细菌来消除植物污染风险等具有重要意义。然而遗憾的是,国内外迄今有关PAHs污染下植物内生细菌的种群和群落结构以及内生细菌中与PAHs降解相关基因的研究仍几近空白。本研究采集了长期在PAHs污染区生长、距污染源不同距离且长势较为一致的两种常见植物—看麦娘和酢浆草,采用有机溶剂萃取法、高效液相色谱分析法(HPLC)、微生物学传统分离培养法,结合现代分子生物学技术中变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析技术,研究了不同PAHs污染强度下两种植物体内内生细菌的种群特性、群落结构分布及变化趋势;分析了植物体内与PAHs代谢相关基因的分布及多样性;验证了分离出的可培养内生细菌对常见PAHs的耐受性。主要研究结果如下：(1)通过传统的涂布平板法,研究了不同PAHs污染区域两种植物体内可培养内生细菌的种群及数量变化。实验结果显示,在PAHs污染场地中生长的两种植物体内均存在有数量可观的可培养内生细菌,但其种群多样性并不高,同时PAHs污染水平可显著影响可培养内生细菌的数量及种群特征。不同PAHs污染区两种植物体内内生细菌的数量为104到107CFU·g-1(鲜重),随着污染程度的增强,其数量不断减少。经形态观察、生理生化特征分析及16SrRNA基因序列同源性鉴定,从两种植物体内共分离出68株可培养内生细菌,分别属于14个属,5个纲,3个门(Firmicutes、 Proteobacteria及Bacteroidetes)。随着PAHs浓度的变化,各种属内生细菌所占比例有所不同,但Bacillus spp.和Pseudomonas spp在不同程度的PAHs污染下均为两种植物体内可培养内生细菌的优势种群。对分离出的68株可培养内生细菌进行PAH耐受性验证,结果表明,大多数内生细菌对不同PAHs具有一定的耐受性,部分内生细菌可利用供试的PAH为唯一碳源或能源进行生长。(2)提取供试植物中内生细菌的总DNA,采用PCR-DGGE技术揭示了PAHs污染区不同植物组织中内生细菌的群落结构及多样性的动态。结果显示,内生细菌的群落结构取决于植物类型、植物组织以及土壤和植物中PAHs的含量。不同污染区、不同植物组织中内生细菌的优势菌群不尽相同,一般来说中低水平PAHs污染条件下植物内生细菌具有较高的多样性,且根组织中内生细菌的多样性要高于茎叶组织。如低污染区看麦娘根中内生细菌的香农-威尔指数(Shannon-Wiener Index)为3.38,而高污染区看麦娘茎叶中内生细菌的香农-威尔指数仅为2.74。实验从两种植物内生细菌16S rRNA基因V3区的DGGE凝胶中分离、鉴定出77条序列,其中大部分属于不可培养细菌(uncultured bacteria).通过系统进化分析可得,这77条序列分别属于4个门：Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria及Bacteroidetes。数据结果分析显示,不论在何种PAHs污染条件下,Proteobacteria均为两种供试植物体内的优势菌群。(3)选用萘双加氧酶(NAH)基因和苯酚单加氧酶(PHE)基因这两种与植物体内PAHs代谢密切相关的基因,采用PCR-DGGE技术研究了PAHs污染下两种基因在看麦娘和酢浆草组织内的分布及多样性情况。研究结果表明,不同浓度的PAHs污染下,两种植物组织内均含有一定量的NAH基因和PHE基因,其中PHE基因的含量要高于NAH基因。从两种基因的DGGE凝胶中共分离鉴定出48条优势条带的序列,其中NAH基因9条,PHE基因39条。