产甲酸草酸杆菌oxc基因的克隆、测序及其核心区的原核表达

作     者：张宇霞 

作者单位：甘肃农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴润;李儒

授予年度：2007年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 071005[理学-微生物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 10[医学] 

主      题：产甲酸草酸杆菌 草酰辅酶A脱羧酶 oxc基因 克隆 原核细胞表达 

摘      要：【目的】本研究拟以产甲酸草酸杆菌草酰辅酶A脱羧酶oxc基因克隆为实验材料，构建产甲酸草酸杆菌草酰辅酶A脱羧酶oxc基因核心区重组表达质粒pET-OXC-1(202～351aa)、及其原核表达重组菌，以获得有活性的oxc基因核心区重组蛋白，进而为建立检测机体内分解草酸的草酰辅酶A脱羧酶及其含量的方法提供实验材料，并为预测机体罹患肾结石的风险和及早进行预防研究奠定基础。 【方法】本实验以产甲酸草酸杆菌标准菌株(ATCC 35274)基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得草酰辅酶A脱羧酶基因oxc(1704bp)并构建重组质粒pGEM-T-oxc。应用DNA重组技术，构建草酰辅酶A脱羧酶oxc基因核心区的原核表达载体pET-OXC-1(202～351aa)，转化BL(DE)并筛选重组菌*** His-OXC-1。在优化条件下诱导重组菌表达，收集菌体经超声波破碎和裂解后提取不溶性包涵体，以8mol／L尿素处理包涵体提取物并进行Ni-NTA亲和层析纯化，纯化表达产物经透析复性后以SDS-PAGE分析其复性效果。 【结果】本研究成功获得重组菌*** His-OXC-1，经诱导表达后可产生分子质量约为19.8ku的目的融合蛋白，其以包涵体形式存在于菌体内;在37℃以1.0mmol／L IPTG诱导表达6 h的优化条件下，重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30％～45％的目的蛋白;裂菌后获得分子质量约为19.8 ku的目的包涵体蛋白;经Ni-NTA亲和层析纯化后，可除去分子质量约为31～40 ku间的杂蛋白，获得分子质量约为19.8 ku的高纯度目的蛋白;复性产物保持较高的纯度，SDS-PAGE仅显现分子质量约为19.8 ku的目的蛋白条带。 【结论】从产甲酸草酸杆菌(ATCC 35274)，克隆出编码草酰辅酶A脱羧酶的oxc基因，成功构建了草酰辅酶A脱羧酶oxc基因核心区重组表达质粒pET-OXC-1(202～351aa)并获得其原核表达重组菌*** His-OXC-1，获得了有活性的oxc基因核心区重组蛋白。