云南个旧肺腺癌细胞株GLC-82 cDNA文库的构建和鉴定

作     者：李晓进 

作者单位：昆明医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：王秦秦;周克敏

授予年度：2005年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肺癌 cDNA文库 构建 

摘      要：目的 采用SMART(switching mechanism at 5’ end of RNA transcript)技术,构建了人肺腺癌细胞株GLC-82 cDNA文库,以期进一步分离人肺癌组织特异表达基因和肺癌特异相关基因。方法 从生长良好的人肺腺癌细胞株GLC-82中提取总RNA,利用经修饰的oligo(dT)引物(含Sfi Ⅰ B酶切位点)合成cDNA第一链,利用点突变的鼠莫洛尼氏白血病毒逆转录酶在序列合成的末端会自动加上3个胞嘧啶核苷酸的特性,SMART核苷酸(含Sfi Ⅰ A酶切位点)的3′为正好与之互补的3个鸟嘌呤核苷酸,可以作为cDNA第一链在mRNA5′端延伸出去的模板,进而以此序列的前23个核苷酸序列为引物利用LD-PCR(long-distance PCR)合成双链cDNA,双链cDNA经Sfi Ⅰ(Ⅰ A和Ⅰ B)酶切和过柱分级分离后,克隆入经Sfi Ⅰ酶切的Lambda TripIEx2噬菌体载体后经体外包装而成cDNA文库。结果 人肺腺癌细胞株GLC-82 cDNA文库构建成功,原始文库获得1.356×10pfu个重组子,重组率为95%,文库扩增后,滴度达6.5x10pfu/ml,插入cDNA的长度为750-2500bp。结论 所构建的cDNA文库具有较好的质量,该文库为进一步筛选、克隆肺癌特异表达基因奠定了基础。