兔MODY-2模型的构建及药物筛选

作     者：王勇 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赖良学

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：MODY2 CRISPR/Cas9 兔,GCK 药物筛选 

摘      要：糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一种代谢性疾病,由遗传因素与环境因素共同作用引起,特点是高血糖,胰岛素抵抗和体内胰岛素不足。糖尿病的危险因素包括基因突变、家族遗传史、体型肥胖、饮食应激等。糖尿病主要分为以下四大类:⑴:1型糖尿病,胰岛素依赖型糖尿病,由体内胰岛素绝对缺乏引起;⑵:2型糖尿病,成人起病型糖尿病,患者体内产生胰岛素的能力并没有完全丧失,有的甚至产生过多,但是胰岛素的作用效果较差;⑶:特殊型糖尿病,由环境因素和遗传因素引起的,病因相对明确;⑷:妊娠糖尿病,妊娠期间才被诊断出的糖尿病。成人起病的青少年糖尿病(MODY)在上世纪60年代由Fajns发现,现己明确,MODY具有家族遗传史,青少年开始发病,非肥胖等特征。在欧洲国家,MODY的发病率约占总糖尿病人1%-2%。然而由于MODY患者的独有特征,会出现与1型和2型重叠的现象,所以会发生误诊现象,导致实际患病率被低估。资料统计显示,在英国就有80%以上的MODY患者被误诊,然而MODY的最终确诊需要13年。我国对于MODY的研究起步相对较晚,研究结果表明,MODY占中国人早发或多发糖尿病人家系的2%-10%。虽然我国存在MODY患者诊断困难,而且发病率低的现象。但是研究该病意义重大。第一:正确诊断MODY患者,对病人的治疗有指导意义,研究表明,GCK突变发生的MODY2是最常见的MODY亚型;第二,正确的诊断有助于后期的治疗,因为MODY患者通过饮食和运动即可控制血糖水平,无疑会使病人的心理负担极大地减轻。第三,作为一类显性遗传疾病,在分子层面的正确诊断,能为人们提供遗传类疾病的参考;最后,MODY模型的建立,可以作为疾病研究的模型,有助于疾病发病机理的研究和临床药物的筛选。现已明确GCK是MODY2疾病的致病基因,GCK主要在肝细胞和胰岛β细胞中表达。GCK基因位于染色体7p1513,全长约27kb,共有12个外显子。GCK由448个氨基酸残基构成,折叠成大小不等的2个结构域。随着人类对疾病认识逐渐深入,研究发现绝大多数疾病的发生都和基因有关。因此,是否能更有针对性的建立与人类疾病有关的动物模型,选择出针对不同疾病的靶向药物是最具有前沿性的课题。本实验通过CRISPR/Cas9基因敲除技术对GCK基因进行修饰,成功构建GCK基因打靶载体,利用Cas9/sg RNA m RNA注射法获得GCK基因敲除兔。研究结果表明,与正常兔相比,GCK基因敲除兔具有血糖长期升高,糖耐量受损,胰岛素分泌减少等典型的MODY2临床症状。而且,我们对多种临床药物进行了筛选,选取格列美脲,瑞格列奈,西格列汀,二甲双胍和胰岛素这五种临床常用药物进行治疗。针对药物的不同疗效,我们选择格列美脲进行长期给药,通过血清学和病理组织学分析,结果显示MODY2疾病症状发生了明显改善。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9技术,成功构建了GCK基因敲除兔,其可为MODY2临床预防治疗提供可靠的模型,并且筛选出针对MODY2有效药物。