基于UPLC/Q-TOF MS代谢组学和DGE转录组学技术研究远志中三萜皂苷的生物合成规律

作     者：薛英 

作者单位：山西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦雪梅;张福生

授予年度：2015年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：远志 DGE UPLC/Q-TOF MS 代谢组学 qRT-PCR 三萜皂苷 生物合成 

摘      要：选题依据：远志皂苷是三萜类皂苷的一种,为远志药材次生代谢产物中最重要的组成成分,其已被证实的药理活性有镇静祛痰、益智安神及抗衰老等。提高远志药材中远志皂苷的含量,对探究远志药材的质量具有重要意义,为总皂苷定向育种、研制总皂苷新药提供原料。而远志药材中远志皂苷含量的提高,主要依赖于对远志皂苷生物合成途径起关键作用的基因以及其对调控的全面了解。目前,通过基因调控手段完成远志次生代谢产物调控的方案尚存在以下问题：(1)国内外学者对于远志药材的研究大多集中于对其药理活性、化学成分和栽培技术等方面的研究,而分子水平方面的研究则比较少,远志相关酶基因数据库更是缺乏。(2)远志皂苷为三萜皂苷类化合物,其下游代谢通路每个物种都有其各自的规律,研究的较少。(3)本课题组前期已采用第二代高通量Illumina测序技术对远志根组织的转录组进行了研究,但该技术只能测得远志药材中的全部基因,并不能提供其准确含量。目的：1.基于数字表达谱(DGE)高通量测序技术进行远志表达谱研究,丰富远志的基因资源。2.通过荧光定量PCR (qRT-PCR)技术和串联四级杆飞行时间质谱仪联用(UPLC/Q-TOF MS)植物代谢组学技术结合,分析远志三萜皂苷的峰强度与远志三萜皂苷的合成途径中关键酶基因表达高低的相关性,找到影响不同发育阶段远志皂苷合成途径中差异表达的功能基因,为今后在分子生物水平上调控远志皂苷的含量奠定基础。方法：1.应用DGE高通量测序技术对远志根组织进行表达谱测序,并在分子生物学水平上进行分析,以获得大量远志基因信息。2.采用UPLC/Q-TOF MS代谢组学技术,对不同发育阶段远志进行代谢组学研究,分析并指认次级代谢物在不同发育阶段的含量差异。3.基于先前DGE表达谱数据库,采用qRT-PCR技术,运用2-ΔΔCr法对涉及远志三萜皂苷生物合成途径的21条基因在远志不同发育阶段表达水平进行分析。通过皂苷合成途径中酶基因表达与UPLC/Q-TOF MS皂苷峰强度的结合分析,描述造成不同发育阶段间远志次生代谢产物差异的分子机理。结果：1.本研究对不同发育期远志的DGE转录组测序数据进行了分析和组装统计,结果得到39,625条Unigenes,总长54,594,810 bp;通过分别与Nr、GO数据库、KO数据库、NOG数据库及Swissprot蛋白数据库进行比对,对Unigenes进行了功能比对和注释。2.成功构建了6Y、9Y和11Y,3个不同发育阶段远志药材的DGE文库。12,187条参与代谢途径的Unigenes,共找到419条代谢途径。6Y与9Y,9Y与11Y,6Y与11Y相比,分别有1,143、520和1,625条差异表达基因。3.通过UPLC/Q-TOF MS对化合物进行鉴定与指认,共鉴定出24个化合物,其中包括6个蔗糖酯类物质、2个口山酮类物质、10个低聚糖酯类物质及6个三萜皂苷类物质。最终确定皂苷Polygalasaponin XXVIII、蔗糖酯Sibiricoses A5、 Tenuifoliside A与低聚糖Tenuifoliose K、 Tenuifoliose E是影响不同发育阶段远志药材的有效物质。4.采用2-ΔΔCT法对远志皂苷生物合成途径涉及的21种关键基因在远志不同发育阶段的表达水平进行了分析,通过远志三萜皂苷峰强度与远志皂苷合成途径中酶基因表达的相关性分析,发现基因CYP716B1、CYP98A3、CYP86B1、CYP94A1和UGT83A1与皂苷合成密切相关。结论：本研究采用DGE高通量测序技术对不同发育阶段远志进行表达谱测序研究,获得远志大量的基因信息。结合UPLC/Q-TOF MS代谢组学技术与qRT-PCR基因表达技术,研究远志皂苷类成分的含量与其合成途径中细胞色素P450酶与糖基转移酶基因的表达规律,从皂苷合成途径中酶基因表达与皂苷含量的相关性来解释造成远志三萜皂苷含量差异的分子机理,最终本研究首次筛选出CYP716B1、CYP98A3、CYP86B1、CYP94A1和UGT83A15个对远志三萜皂苷的合成起关键作用基因。